中醫(yī)學(xué)開題報告

　　中醫(yī)學(xué)-中醫(yī)學(xué)是研究人體生理病理，疾病診斷與防治以及攝生康復(fù)的一門傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)科學(xué)，至今已有數(shù)千年的歷史。對于如此深厚的東西，當(dāng)然是要研究了!那么對于如何寫中醫(yī)學(xué)開題報告，是否有很多疑惑呢?今天小編收集了相關(guān)范文，供大家參考!

　　中醫(yī)學(xué)開題報告篇一：

　　選題依據(jù)、目的和意義：

　　骨折不愈合是骨科臨床常見病癥，其中以四肢長骨多發(fā)，例如脛骨，股骨，肱骨等，針對四肢長骨骨折不愈合二次手術(shù)我院多才用植骨術(shù)配合LCP重新內(nèi)固定。自體髂骨作為植骨材料具有較多的優(yōu)點：如取材簡單、組織相容性好、無移植排斥反應(yīng)、骨誘導(dǎo)作用強等，這些優(yōu)點使得髂骨成為一種最佳的植骨供材，這在臨床上已形成共識。植骨是治療骨折不愈合的重要方法,其機制是爬行替代所引起的支架作用與供給礦物質(zhì)的作用,爬行替代順利進行的條件要求準(zhǔn)確的復(fù)位、充分的植骨和堅強的固定。為達到充分的植骨，及早促進骨折愈合，我們采用髓內(nèi)外36°植骨的方法，外用鋼絲環(huán)扎，配合LCP堅強內(nèi)固定，術(shù)后3~1個月內(nèi)進行隨訪，根據(jù)愈合情況和功能恢復(fù)情況分析手術(shù)的臨床療效。選題目地在于探討治療四肢長骨骨折不愈合的手術(shù)改進方法和療效，為臨床治療提供參考。

　　本課題目前國內(nèi)外研究的動態(tài)、水平

　　治療骨折不愈合，可分為手術(shù)治療和非手術(shù)治療，其中手術(shù)治療最重要的就是植骨術(shù)加更改斷端內(nèi)固定。骨折不愈合應(yīng)用自體骨移植治療效果顯著，已經(jīng)形成共識。 植骨是治療骨不連的重要方法,植骨方式臨床多采用髓內(nèi)外聯(lián)合植骨。沿肌間隙進入, 骨膜下小心剝離顯露骨折部位, 取出內(nèi)固定器械, 清除骨斷端間瘢痕, 咬除硬化骨, 打通髓腔, 修整骨折端, 手法復(fù)位, 按照骨缺損情況取骨。髓內(nèi)植骨以比髓腔稍粗的骨棒,貼緊髓腔骨質(zhì);髓外上蓋植骨宜用螺絲釘固定植骨塊;骨碎屑充分填充殘余的空隙,這樣才能確實達到植骨的目的和要求。自體皮- 松質(zhì)骨植骨的爬行替代縮短了骨折愈合過程,新鮮的自體骨具有生物活性,不存在免疫排異,無傳染疾病的風(fēng)險,同時存在骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)能力。

　　內(nèi)固定物更換得堅持以下原則，原鋼板內(nèi)固定者,可更換成交鎖髓內(nèi)針或更長的鋼板置于張力側(cè);原交鎖髓內(nèi)針內(nèi)固定者,可選用更大號髓內(nèi)針或鋼板內(nèi)固定;原先短鋼板內(nèi)固定者，可改成較長的鋼板。所有病例均需植骨。更換內(nèi)固定物后,，術(shù)后石膏外固定者,應(yīng)及早進行肌肉收縮鍛煉活動,骨痂生長良好后,去石膏開始關(guān)節(jié)屈伸功能鍛煉。但是臨床上醫(yī)師應(yīng)該具體問題具體對待，可以根據(jù)骨痂生長情況酌情處理,出院時務(wù)必詳細醫(yī)囑病人注意事項,配合醫(yī)生,直到骨折完全愈合。 LCP鋼板內(nèi)固定適用于四肢長骨骨折不愈合,可用拉力螺釘固定碎骨塊及移植骨塊, 并對斷端行軸向加壓鎖定。手術(shù)關(guān)鍵是將骨折端的瘢痕結(jié)締組織全部切除, 骨端硬化骨全部咬除, 露出正常骨質(zhì), 鉆通髓腔, 植入的骨塊必須牢固的嵌入缺損區(qū), 間隙用松質(zhì)骨填滿,。應(yīng)積極正確指導(dǎo)術(shù)后功能鍛煉, 嚴格定期隨訪及指導(dǎo)。避免過早的不正確的負重。。綜上所述，對于骨折不愈合的治療，自體骨移植療效確切，安全穩(wěn)妥，技術(shù)成熟，應(yīng)用廣泛，值得提倡。

　　課題研究的主要內(nèi)容

　　病例來源

　　本研究病例均采集于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨科病房

　　采集時間 2015年5月～2016年1月

　　診斷標(biāo)準(zhǔn)

　　(1)病史：明確的外傷史，骨折后6個月沒有愈合，并且沒有進一步愈合傾向已有3個月。

　　癥狀：患者骨折端成角、旋轉(zhuǎn)、側(cè)移位、短縮畸形或者節(jié)段性骨缺損、持重疼痛或不能持重、局部在應(yīng)力下疼痛等。

　　(3)體征：局部竇道形成、流膿、假關(guān)節(jié)形成或伴有局部軟組織瘢痕、缺損等

　　(4)輔助檢查：X線表現(xiàn)：骨端硬化，髓腔封閉;骨端萎縮疏松，中間存在較大的間隙;或骨端硬化，相互成為杵臼假關(guān)節(jié)等這三種形式中的任何一種就可以定為骨折不愈合。

　　納入病例標(biāo)準(zhǔn)：

　　(1)符合本病診斷標(biāo)準(zhǔn);

　　骨折平均愈合時間超過半年以上，有假關(guān)節(jié)形成;

　　(3)骨折平均愈合時間超過半年以上，多次復(fù)查X線拍片顯示，骨折線

　　清晰可見，未見內(nèi)外骨痂或內(nèi)外骨痂極少;

　　(4)拍片顯示骨折線增寬，骨折端骨面致密性硬化，骨髓腔封閉，骨質(zhì)疏松，骨痂間無骨小梁形成，或伴有明顯的骨缺損;

　　(5)臨床表現(xiàn)有骨的感染、缺損、畸形、肢體不等長、局部竇道形成、流膿等。

　　排除病例標(biāo)準(zhǔn)：

　　(1)不符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)者

　　患者有嚴重的內(nèi)科疾病，不能夠耐受手術(shù)者

　　(3)精神疾病患者

　　療效觀察方法

　　對骨不連愈合的評價應(yīng)包括骨愈合和功能恢復(fù)雙重評價：

　　(1)骨愈合評價標(biāo)準(zhǔn)：本評價結(jié)果決定于四項指標(biāo):骨愈合、感染、畸形和肢體長度，其中骨愈合標(biāo)準(zhǔn)為X線示骨折線模糊，有連續(xù)骨癡通過骨折線，拆除或試行松動外固定物后骨折無異?；顒樱轮蔁o痛行走，上肢持物骨折處有穩(wěn)定感。

　　評價標(biāo)準(zhǔn):

　　優(yōu):骨折愈合，無感染，斷端畸形《°，雙側(cè)肢體不等長《 CM。

　　良:骨折愈合及其他三標(biāo)準(zhǔn)中兩項。

　　可:骨折愈合及其他三標(biāo)準(zhǔn)中一項。

　　差:骨折未愈合或再骨折或雖愈合但不具備其他三標(biāo)準(zhǔn)中任何一個。

　　功能評價標(biāo)準(zhǔn)

　　功能的評價分上肢與下肢的不同，上肢主要考慮其靈活性，而下肢主要功能為負重行走。

　　將下肢評價指標(biāo)定為以下五項:①明顯跛行;②踝或膝任何一關(guān)節(jié)僵硬(完全伸膝或踝完全背伸時，活動范圍較正?；?qū)?cè)喪失15°以上):③軟組織情況不良;④有限制活動或影響睡眠的疼痛存在:⑤喪失工作能力或生活不能自理。

　　優(yōu):存在工作能力且無其他四項指標(biāo)。

　　良:存在工作能力且具以上四指標(biāo)中一至二項。

　　可:存在工作能力并具以上指標(biāo)中三至四項。

　　差:喪失工作能力或生活不能自理，不考慮是否具備其他指標(biāo)。

　　對上肢功能評價參照 Seu和Hdlly對上肢功能評價標(biāo)準(zhǔn) [3]

　　觀察指標(biāo)為三項:疼痛、關(guān)節(jié)活動范圍、日?；顒幽芰?。

　　l:上肢功能評價標(biāo)準(zhǔn)

　　分數(shù) 痛疼 任一關(guān)節(jié)活動受限 日常活動差 無用力或疲勞后 持續(xù)性 《°~4°》4°

　　完全不受限

　　輕微受限

　　嚴重受限

　　課題進度及安排：

　　收集病例及隨訪

　　撰寫論文、定稿

　　可行性分析

　　四肢長骨骨折不愈合由于并發(fā)癥較多，治愈比較困難，手術(shù)后功能恢復(fù)過程漫長，因此在治療過程中，經(jīng)驗的總結(jié)是非常必需的，也是可行的。本課題主要研究山東省中醫(yī)院近年應(yīng)用鋼絲環(huán)扎36°植骨配合LCP內(nèi)固定治療四肢長骨骨折不愈合的治療效果分析情況，因此在選題上可行性較強。課題的研究也得到了學(xué)校、附院等各部門、科室的大力支持。相信可以圓滿地完成課題。

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　　中醫(yī)學(xué)開題報告篇二：

　　百合知母湯抗抑郁細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的機制研究

　　研究生姓名：***

　　導(dǎo)師姓名、職稱：**** 教授

　　學(xué)科專業(yè)：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

　　研究方向：方劑的配伍規(guī)律及臨床運用

　　一 研究目的與意義

　　1.研究目的

　　百合病最早見于張仲景的《金匱要略》，屬中醫(yī)情志病范疇?！督饏T﹒百合狐惑陰屬陽毒病證治》篇將“百合病”描述為：“意欲食復(fù)不能食，常默然，欲臥不能臥，欲行不行，飲食或有美時，或有不用聞食臭時，如寒無寒，如熱無熱，口苦，小便赤，諸藥不能治，得藥則劇吐利，如有神靈者，身形如和，其脈微數(shù)。”從百合病的臨床表現(xiàn)看，與抑郁癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)有較多的相似之處。所以現(xiàn)代不少醫(yī)家都將中醫(yī)的百合病歸屬于抑郁癥[1,2,3]。百合知母湯為治療百合病的經(jīng)典方藥之一，由百合和知母兩味藥組成。百合寧心安神，潤肺止咳;知母清熱瀉火，滋陰潤燥。百合甘寒清潤而不膩，知母苦寒降火而不燥。百合偏于補，知母偏于瀉。二藥伍用，一潤一清，一補一瀉，共奏潤肺清熱，寧心安神之效。主治陰虛或溫?zé)岵『笥酂崮┣?，以致頭昏、心煩不安、失眠等癥以及情志不遂，以致精神恍惚、不能自制等癥。 故本課題旨在通過體動物實驗揭示百合知母湯抗抑郁可能的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。

　　2.研究意義

　　抑郁癥是常見的危害人類身心健康一類精神疾病，以顯著而持久的情感或心境低落為主要特征，在WHO的一項流行病學(xué)調(diào)査中發(fā)現(xiàn)全世界約有10%-20%的人一生中曾有過抑郁體驗[4]。隨著現(xiàn)代社會的生活壓力逐漸增高、工作節(jié)奏加快，人們處于應(yīng)激狀態(tài)中的機會增多，抑郁癥的發(fā)病率更逐年上升[5,6]，越來越多的患者正遭受抑郁癥的折磨，給家庭及社會造成了嚴重的經(jīng)濟負擔(dān)。因此，加強抑郁癥的防治，尋找安全、有效的治療方法，具有非常重要的社會和經(jīng)濟意義。

　　抑郁癥發(fā)病機制復(fù)雜，誘因繁多，針對某一單一環(huán)節(jié)的藥物難以取得滿意的療效，許多抗抑郁西藥存在抗抑郁譜窄、起效慢、藥價高、依從性差、副作用大及易復(fù)發(fā)等不足[7]。傳統(tǒng)的中醫(yī)學(xué)中蘊含著豐富的心身醫(yī)學(xué)思想，其“形神合一論”，“天人合一論”就包含了廣義的心身醫(yī)學(xué)思想。因此國內(nèi)外越來越重視傳統(tǒng)中草藥及復(fù)方抗抑郁的研究，開展了廣泛而深入的實驗研究，積累了豐富的經(jīng)驗，且實驗研究成果在臨床運用中也取得了良好的療效，為中醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代心身醫(yī)學(xué)的融合、發(fā)展提供了新的契機。中醫(yī)心身醫(yī)學(xué)研究工作逐漸起步，心身醫(yī)學(xué)的中醫(yī)藥防治研究工作在病因病機及臨床診斷方面也取得一定的進展[8]。

　　隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，抗抑郁藥物抗抑郁作用機制已由細胞外單胺遞質(zhì)途徑，逐步轉(zhuǎn)向細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，而目前針對百合知母湯抗抑郁作用機制的研究大都局限在行為學(xué)觀測、腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)內(nèi)分泌等方面。本研究采用大鼠慢性應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)抑郁模型，對百合知母湯的抗抑郁作用及其細胞內(nèi)作用機制進行研究，以期為其進一步的新藥開發(fā)研究和臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

　　二 研究現(xiàn)狀

　　1.百合病的研究現(xiàn)狀

　　1.1百合病的起源

　　百合病始見于張仲景《金匱要略·百合狐惑陰陽毒病證治第三》篇：百合病者，百脈一宗，悉致其病也。意欲食復(fù)不能食，常默然，欲臥不能臥，欲行不能行，飲食或有美時，或有不用聞食臭時，如寒無寒，如熱無熱，口苦，小便赤，諸藥不能治，得藥則劇吐利，如有神靈者，身形如和，其脈微數(shù)。這段文字概括了百合病的主要癥狀是精神、飲食、睡眠、行為、語言、感覺的失調(diào)，與西醫(yī)學(xué)抑郁癥的主要癥狀有頗多相似之處。“百脈一宗者，分之則為百脈，合之則為一宗”因人體百脈同出一源，源病則百脈合病，周身受累，因此而得名百合病。

　　1.2百合病的病因病機 百合病的病因病機為傷寒熱病之后，余熱傷陰，或情志不遂，郁熱傷陰，導(dǎo)致心肺陰虛內(nèi)熱，百脈失養(yǎng)而成。病機特點是心肺陰虛內(nèi)熱，心神失養(yǎng)，以神志改變?yōu)橹饕R床特點。心肺陰虛，余邪未盡，則出現(xiàn)口苦、小便赤、脈微數(shù)。該組癥狀是百合病的主要客觀體征。百脈遍布周身，百脈失和，則行動感覺變異，如“欲臥不能臥，欲行不能行”“意欲食復(fù)不能食，飲食或有美時，或有不用聞食嗅時”“如寒無寒，如熱無熱”等。神志失和，則現(xiàn)“如有神靈者”“常默默”。

　　1.3百合病的治療法則

　　百合病以心肺陰虛為基本病機，以滋養(yǎng)心肺、潤燥安神為治療法則?？?ldquo;隨證治之”分為以下幾型：①正治法：“百合病，不經(jīng)吐、下、發(fā)汗，病形如初者，百合地黃湯主之。”百合病未經(jīng)誤治，日雖久而病形如初者，以滋養(yǎng)心肺陰血，清熱安神為法，以百合地黃湯主之。取百合潤養(yǎng)心肺，清氣分虛熱，生地滋養(yǎng)心血，清血分虛熱，泉水煎藥，取清熱助陰，血熱從小便下行之功。諸藥合用，心肺得養(yǎng)，氣血同治，陰復(fù)熱清，百脈和調(diào)，病癥自除。②誤汗后：“百合病發(fā)汗后者，百合知母湯主之。” 百合病誤用汗法，汗后陰液受傷，心肺陰虛加重，燥熱尤甚，除具備百合病的基本癥狀外，尚可出現(xiàn)津傷燥熱的心煩、少寐、口干或渴、午后潮熱、小便短少等癥候。治宜養(yǎng)陰清熱、潤澡除煩，用百合知母湯主治。③誤下后的滑石代赭湯(百合、滑石、代赭石)。④誤吐后的百合雞子湯(百合、雞子黃)。⑤久病變渴的外用百合洗方(百合)。如內(nèi)服外洗仍口渴不解，方用栝蔞牡蠣散(栝蔞根、牡蠣)。⑥久病變發(fā)熱的百合滑石散(百合、滑石)。

　　2.抑郁癥的研究現(xiàn)狀

　　2.1抑郁癥的起源

　　抑郁癥是一種情感性精神障礙，臨床上以情緒低落、思維遲緩和精神運動性抑制為特征，其它癥狀包括喪失自尊、不恰當(dāng)?shù)膬?nèi)疚感、死亡和自殺念頭、注意力集中程度降低以及睡眠和食欲減退，還可能伴有各種軀體癥狀。

　　抑郁癥是一種最普通的精神疾病。我國對情感性精神障礙進行流行病學(xué)調(diào)查1985年：終生患病率約為12%。我國對抑郁癥的識別率低,臨床漏診率達50-60%。一般內(nèi)科醫(yī)生對包括抑郁癥在內(nèi)的心理障礙的識別率只有15.9%,約只有1/4的抑郁癥病人才能接受正規(guī)治療。有專家認為我國抑郁癥的發(fā)病率應(yīng)為10-15%，隨著人口的逐步老齡化，抑郁癥在60歲以上人群中的發(fā)病率將高達 20%～50%。1994年WHO全球調(diào)查發(fā)現(xiàn),抑郁癥的現(xiàn)癥患病率現(xiàn)癥患病率為11.4%,終生患病率為20-30%。約13 - 20%的人一生中曾有過至少一次抑郁體驗?！?001 年世界衛(wèi)生報告》指出，抑郁癥目前已成為世界第四大疾患，到 2020 年抑郁癥可能成為僅次于心臟病的第二大疾病，抑郁癥正在成為一個嚴重的全球問題[9-13]。

　　2.2抑郁癥的發(fā)病

　　抑郁癥的病因十分復(fù)雜，一般認為病因可能與遺傳、人格特征、心因因素有關(guān)。其發(fā)病機制也處于假說階段，主要包括單胺遞質(zhì)學(xué)說、神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)說、信號通路學(xué)說[14-15]。

　　單胺假說作為抑郁癥研究的重點認為單胺類神經(jīng)遞質(zhì)(如5-輕色胺、多巴胺、去甲腎上腺素等)的失衡可導(dǎo)致抑郁的發(fā)生。大量研究亦顯示抑郁癥與遺傳、神經(jīng)、心理等因素誘發(fā)的中樞5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺(Norepinephrine,NE)、多巴胺(Dopamine, DA)等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量降低及其受體功能下降有關(guān) [16-17]。有研究[18]表明抑郁模型大鼠下丘腦、紋狀體、海馬內(nèi) 5-HT、NE及DA 及其代謝產(chǎn)物、合成前體的含量明顯降低。這也支持了經(jīng)典的單胺遞質(zhì)學(xué)說。①5-HT：抑郁癥的發(fā)病機制涉及突觸間隙5-HT水平及5-HT受體亞型功能的失調(diào)。5-HT功能活動降低,則患者心情抑郁、食欲減退、運動活動減少。Coppent[19]等于1965年首先提出5-HT與抑郁癥有關(guān),認為抑郁癥是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT釋放減少,突觸間隙的含量下降而引起的。近年來,研究發(fā)現(xiàn)了很多5-經(jīng)色胺的受體亞型,使得5-HT遞質(zhì)系統(tǒng)與抑都癥發(fā)病的關(guān)系越來越受到關(guān)注。②NE：大量研究證明腦內(nèi)N E的絕對或相對缺乏會引起情緒低落、心境抑郁。Schildkraut[20]于1965年首先提出抑郁癥的發(fā)生是由于腦中NE不足所致,中樞神經(jīng)系統(tǒng)中NE含量不足則發(fā)生抑郁癥NE的缺乏可能是由于內(nèi)源性的生成釋放異?；蛴捎贜E系統(tǒng)慢性刺激所致的繼發(fā)性粍竭[21]。Bmnello[22]等指出,自從發(fā)現(xiàn)一些藥物通過改變NE代謝既能導(dǎo)致抑郁癥又能緩解抑郁癥,NE在抑郁癥中所起的作用越來越受到關(guān)注。③DA：1975年Randrup首先提出,抑郁癥的發(fā)病可能與DA有關(guān)。后來Maj等研究者證實,幾乎所有長期抗抑郁治療的患者都會增加D A誘導(dǎo)的獎賞反應(yīng)。1983年Willner等提出抑郁癥存在DA功能的降低,尤其是伴隨有精神運動遲滯的患者[23]。對抑郁癥自殺者尸檢結(jié)果提示,抑郁癥自殺患者尾狀核和伏核的DA代謝率降低[24]。

　　目前,抑郁癥的神經(jīng)內(nèi)分泌機制研究中,下丘腦一垂體一腎上腺軸(HPA軸)功能亢進是較為公認的發(fā)病機制之一。大量研究顯示,抑郁癥患者的HPA軸功能 亢進,血漿促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素CHR、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和皮質(zhì) 醇(CORT)濃度明顯升高,而且這種功能亢進是依賴性的,隨著抑郁的恢復(fù),HPA軸的功能也逐步恢復(fù)正常[25]。Catalan[26]等發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者下丘腦及下丘腦外的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)濃度都升高,重度抑郁組比輕度與中度抑郁發(fā)作CRF血濃度更高,且CRF與皮質(zhì)醇血濃度顯著相關(guān)。 在發(fā)病機制方面，受體后信號通路及其第二信使系統(tǒng)在該病發(fā)病及治療中的作用是當(dāng)前研究的熱點。以腦內(nèi)cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein ,CREB )為交匯點的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路正受到越來越多的關(guān)注，尤其是海馬CREB的改變。早在1996 年，Nibuya[27]等就報道抗抑郁治療，大鼠海馬 CA1 區(qū)、CA3 區(qū)和齒狀回均可見CREB mRNA的表達增多。CREB 可能是各種抗抑郁信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交匯點。海馬CREB的表達和活化受到多種信號分子和信號通路的影響：

　?、傧佘账岘h(huán)化酶/環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A通路(AC/cAMP/PKA通路)，是研究最早的抗抑郁通路。其主要過程是：胞外信號激活胞膜上G蛋白耦聯(lián)受體→AC激活→胞內(nèi)cAMP升高(降解cAMP的酶主要是磷酸二酯酶)→PKA激活→CREB磷酸化→調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄→生物學(xué)效應(yīng)。Li和Branski[28,29]等實驗研究發(fā)現(xiàn)海馬cAMP通路的激活對改善抑郁癥狀起積極作用。

　?、诶野彼峒っ甘荏wB/絲裂原活化蛋白激酶/核糖體 S6激酶通路(TrKB/MAPK/RSK通路)，是一條和細胞生長、增殖、凋亡以及突觸可塑性密切相關(guān)的信號通路。在各種 MAPK 通路中，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2 (ERK1/2)信號通路與抑郁癥關(guān)系最為密切。ERK1/2 通路激活的大致過程是：TrKB 的激活→MAPK激酶激酶(MAPKKK, RAF)的激活→MAPK激酶(MAPKK, MEK)的激活→ERK1/2的激活→RSK的激活→ CREB 磷酸化→調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄→生物學(xué)效應(yīng)。抑郁癥患者的尸檢報告顯示腦內(nèi)MAPK減少可能是嚴重抑郁癥的病因之一[30]。

　　③Ca2+/鈣調(diào)蛋白/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶通路(Ca2+/CaM/CaMK通路)，通路涉及多種離子通道、受體和酶，其激活的主要過程是：胞漿內(nèi)鈣濃度升高→鈣離子與CaM結(jié)合→激活CaMK→CREB磷酸化→調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄→生物效應(yīng)。王慶松等 [31]利用貓對大鼠造成急性捕食應(yīng)激，發(fā)現(xiàn)在捕食應(yīng)激后大鼠海馬細胞內(nèi) CaM 信 號通路調(diào)控紊亂，表現(xiàn)在細胞內(nèi) Ca2+濃度明顯升高，Ca2+-CaM 復(fù)合體增多，CaMK的表達升高，提示海馬該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在嚴重心理應(yīng)激所致的行為異常中可能有重要意義。

　　3.百合知母湯的研究現(xiàn)狀

　　3.1百合的研究現(xiàn)狀

　　方中百合為百合科植物百合Lilium brownii F. E. Brown var. colchesteri Wils.、卷丹 Lilium lancifolium Thunb.和細葉百合 Lilium pumilum DC.的肉質(zhì)鱗莖。味甘，性微寒。入心、肺經(jīng)。本品氣味稍緩，甘中有收，既能清心肺之余熱，而斂氣養(yǎng)心、安神定魄，用于治療熱性病后、余熱末盡所引起的神思恍惚、煩躁失眠、莫名所苦的“百合病”，又能潤肺止咳，用于治療肺燥咳嗽，或肺虛久咳，或陰虛久咳、痰中帶血等癥。 百合中主要含有酚酸甘油酯、苷類、生物堿及多糖，另外還含有一些磷脂、蛋白質(zhì)和無機元素。藥理研究表明百合具有抗癌、止咳、耐缺氧與抗疲勞、提高機體細胞免疫功能等作用[32-34]。

　　3.2知母的研究現(xiàn)狀

　　方中知母為百合科植物知母 Anemarrhena asphodeloides Bge.的根莖。味苦、甘，性寒。入肺、胃、腎經(jīng)。本品質(zhì)潤，苦寒不燥、，沉中有浮，降中有升。上行能清肅肺氣，以瀉肺火，潤肺燥、除煩熱、止咳嗽，用于治療溫?zé)岵?，邪在氣分，癥見高熱、煩躁、口渴、脈洪大者，以及陰虛燥咳，或肺熱咳嗽諸癥;入于中，善清胃火、除煩渴，用于治療消渴病之中消諸癥;行于下，則能瀉相火、滋腎燥，用于治療陰虛火旺、骨蒸潮熱、盜汗等癥。

　　知母主要含有皂苷、黃酮、雙苯吡酮、木脂素等成分?，F(xiàn)代研究表明，知母具有抗病原微生物、抗血小板聚集、降血糖、解熱、抗炎、降低轉(zhuǎn)氨酶等多種藥理活性[35-37]。

　　3.3 百合知母湯的研究現(xiàn)狀

　　百合知母湯有養(yǎng)陰清熱、除煩潤燥之效，以潤養(yǎng)心肺為大法，治療百合病誤汗后，津液受傷，虛熱較甚者。臨床上運用百合知母湯治療乳腺增生病[38-39]、長期低熱[40]、消渴、喘證、盜汗、胃脘痛[41]、失眠[42]、抑郁[43]等癥。

　　三 研究思路與立題依據(jù)

　　1.研究思路 百合知母湯是《金匱要略》中治療百合病的經(jīng)典方劑。百合病的描述“百合病者，百脈一宗，悉致其病也，欲臥不能臥，欲行不能行……意欲食復(fù)不能食，常默默，如有神靈者……”主要歸納為情緒障礙、軀體不適，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)抑郁癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)有很大的相似性，因此一般將百合病歸屬于抑郁癥范疇。百合知母湯中的部分有效成分能通過提高抑郁癥大鼠大腦皮層單胺遞質(zhì)、抑制HPA軸亢進、提高模型動物腦組織BDNF含量等途徑發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)。

　　CREB 可能是各種抗抑郁信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交匯點?？挂钟羲幬?包括中藥)或其它治療措施可通過調(diào)節(jié)一種或幾種通路，最終激活CREB，調(diào)節(jié) BDNF 等基因表達，影響神經(jīng)元增殖、分化、成熟等可塑性改變，發(fā)揮抗抑郁作用。參與調(diào)節(jié)CREB的各調(diào)節(jié)因子之間、通路之間存在復(fù)雜的交叉聯(lián)系和相互作用，共同維持著CREB活性的平衡。近年來研究提示：抑郁模型小鼠，存在神經(jīng)元蛋白和營養(yǎng)因子在海馬的表達異常，而這些變化可以被一些中藥逆轉(zhuǎn)[44]。當(dāng)前致力于闡明信號通路、CREB、營養(yǎng)因子、神經(jīng)再生之間是如何相互聯(lián)系的，以及細胞靶點、分子應(yīng)答、行為反應(yīng)的調(diào)節(jié)與抗抑郁之間錯綜復(fù)雜的關(guān)系。這將有助于我們以CREB為中心了解抑郁癥的病理生理機制，并在此基礎(chǔ)上研發(fā)出療效可靠、起效迅速、副作用小、經(jīng)濟實用的新藥，尤其是幫助我們更好地認識一些中藥抗抑郁的可能機制，更充分地利用祖國寶貴的中醫(yī)藥資源。

　　細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是目前抗抑郁機制研究的重點和熱點。可被多種不同的信號路徑激活。環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、鈣調(diào)蛋白激酶(CaMK)等3條通路是目前認為與抗抑郁相關(guān)、最主要的信號通路，這3個主要上游通路最終都使CREB磷酸化，進而調(diào)節(jié)其下游通路的基因表達，完成神經(jīng)元生化功能，而CREB是上述3種通路的交匯點。

　　前期的研究證實：百合知母湯抗抑郁的機制與提高慢性不可預(yù)見性應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)抑郁(CUMS)模型大鼠海馬組織5-HT含量、提高腦組織中CREB(cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白)mRNA的表達有關(guān)(見7.3)。有鑒于此，我們提出假設(shè)：百合知母湯抗抑郁的信號機制可能與以上三種細胞內(nèi)通路有關(guān)，三個通路在抗抑郁機制中可能會有所偏重。

　　圍繞假設(shè)，基于CREB磷酸化通路，本課題擬將百合知母湯作用于CUMS大鼠，運用ELISA、RT-PCR、免疫組化、Western 印記等方法，檢測大腦組織cAMP信號中cAMP和PKA、MAPK信號中TrKB和BDNF、CaMK信號中鈣調(diào)蛋白(CaM)和CaMK等關(guān)鍵因子，初步探討百合知母湯抗抑郁的信號機制,篩選出該方抗抑郁的基因靶點。

　　2.立題依據(jù)

　　中藥復(fù)方具有成分多、作用環(huán)節(jié)多、靶點多的特點，多環(huán)節(jié)之間具有協(xié)同效應(yīng)。因此研究中藥及其方劑的抗抑郁作用具有極大的挖掘潛力，而且對解決日益增加的抑郁患者的痛苦有重大的社會意義[45-46]。

　　四 研究內(nèi)容及目標(biāo)

　　1.建立慢性不可預(yù)見性應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)大鼠抑郁(CUMS)模型;

　　2.通過檢測用藥前后模型動物大鼠海馬組織環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和蛋白激酶A(PKA)含量變化，評價百合知母湯對抑郁癥cAMP信號的干預(yù)作用;

　　3.通過檢測用藥前后模型動物大鼠絡(luò)氨酸激酶受體B(TrKB)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)含量變化，評價百合知母湯對抑郁癥MAPK信號的干預(yù)作用;

　　4.通過檢測用藥前后模型動物大鼠海馬組織中鈣調(diào)蛋白(CaM)和鈣調(diào)蛋白激酶(CaMK)含量變化，評價百合知母湯對抑郁癥CaMK信號的干預(yù)作用;

　　五 擬解決的關(guān)鍵問題

　　通過檢測cAMP、MAPK、CaMK三條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑上重要調(diào)節(jié)因子cAMP、PKA、TrKB、BDNF、CaM、CaMK用藥前后的變化，初步評估百合知母湯對以上三個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的干預(yù)作用，評價方劑抗抑郁的機制，以便進一步篩選出方劑抗抑郁靶點。

　　六 實驗研究方案

　　1.實驗動物 SD雄性大鼠，7—12周齡，體重180—200g 2.藥物制備

　　按照《金匱要略》中記載的方法：百合七枚(劈)(約20g)，知母三兩(切)(約10g)即百合：知母=2:1。取百合100g，知母50g，先以清水將百合浸泡12小時，當(dāng)白沫出，去其水，再加清水2000ml，武火煎開后改為文火，得百合煎煮液1000ml;再用清水2000ml，先武火后文火，得知母煎煮液1000ml;將2次煎煮液混合，文火濃縮得煎煮液1500ml。按照比例配制足夠數(shù)量百合知母湯煎煮液，放入冰箱-20℃儲存?zhèn)溆?。臨用時取出，濃縮至合適體積。為確保實驗結(jié)果的可比性，所有實驗都用同一批藥材。所有藥物的給藥劑量根據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”計算而來：大鼠(200g)用藥量=人(70kg)日用劑量*0.018。每只大鼠的給藥體積為1ml/100g。

　　百合知母湯終濃度為2.2g/Kg/d(成人日用量30g)

　　氟西汀終濃度為1.8mg/kg/d(成人日用量20mg)

　　各組按濃度給藥28天，對照組給等體積的三蒸水。

　　3.CUMS抑郁癥模型大鼠制備

　　除正常對照組外，其余動物采用慢性輕度不可預(yù)見性溫和刺激結(jié)合孤養(yǎng)(CUMS)的造模方法：各造模組大鼠均單籠飼養(yǎng)，刺激因子包括禁食、禁水、4℃冰水游泳、夾尾、晃尾、潮濕墊料和傾斜45°、束縛應(yīng)激、陌生物品、空籠刺激、噪音刺激、閃光刺激、水平震蕩、晝夜顛倒等。每日隨機給予2到3種刺激，使大鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生以避免產(chǎn)生適應(yīng)。每種刺激交叉累計使用2-3次，持續(xù)21天，造模成功后，給藥期間繼續(xù)維持造模。建立慢性溫和不可預(yù)見性應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)(CUMS)抑郁癥大鼠模型,具體操作方法如下：

　　(1)禁水：即24小時不予供水。具體方法為,造模當(dāng)天,上午8:00始,撤出大鼠籠內(nèi)供水瓶,禁水24小時后,于次日上午8:00正常供水。

　　(2)禁食：即24小時禁止進食。具體方法為,造模當(dāng)天上午8:00始,清除鼠籠內(nèi)所有鼠糧,剝奪進食24小時后,禁食期間供水正常。禁食后給少量碎食,然后正常詞養(yǎng).

　　(3)晝夜顛倒：造模當(dāng)天,上午8:00,將正常對照組大鼠轉(zhuǎn)移至其它SPF級實驗室后,關(guān)閉本實驗室所有電源,模仿黑夜,至20:00準(zhǔn)時打開實驗室電源,模仿白晝,給大鼠制造晝夜顛倒的假象。

　　(4)夾尾：用纏裹有膠布的塑料夾,夾持鼠尾根部,時長為5min。

　　(5)晃尾：提住大鼠尾巴中部以每秒鐘1次的頻率,晃尾15分鐘,晃尾時力度要輕柔,避免牽拉大鼠尾尖部位,以防脫皮

　　(6)冰水游泳：取一直徑為30cm玻璃缸,注入適量清水后加入適量冰塊,調(diào)整水溫至4℃(根據(jù)天氣情況,適當(dāng)調(diào)整,以防凍傷),同時調(diào)整水液平面據(jù)器皿邊緣約15-20cm,然后將大鼠放入冰水中,強迫其游泳5min。5min后將大鼠榜出,先用干毛巾擦拭動物毛發(fā),然后用吹風(fēng)機吹干,避免感冒。每次冰水游泳結(jié)束后需撈干凈游泳器皿內(nèi)大鼠類便,避免對下一只鼠產(chǎn)生影響。

　　(7)高速水平震蕩：將動物放入空的鼠籠中，進行人工振蕩，2 次/秒，有效節(jié)奏連續(xù)持續(xù) 5min;或者水平晃動，1次/秒，持續(xù)30分鐘

　　(8)噪音刺激：90分貝噪音刺激2h，盡量選在白天大鼠休息的時候給予此種刺激。

　　(9)束縛刺激：將大鼠束縛于500ml燒杯中2h，注意保持通氣。

　　(10)潮濕環(huán)境：將大鼠的墊料換以潮濕墊料，持續(xù)刺激12h。

　　(11)異物刺激：往大鼠籠內(nèi)放置金屬條棒，鈍性玻璃器皿的異物予以刺激，持續(xù)2h。

　　(12)空 籠：撤掉大鼠籠里面的墊料籠子里不放置任何物品，持續(xù)12h。

　　(13)傾斜刺激,：該刺激因素通常在禁水后進行,應(yīng)激動物本身饑渴,在傾斜的鼠籠中覓食覓水更為困難。

　　(14)閃光刺激：LED頻閃燈，頻閃頻率2次/s，持續(xù)刺激2h。

　　以上各種刺激的實施順序遵循由弱(輕刺激,如晝夜顛倒、禁水禁食、潮濕環(huán)境)到強(重刺激,如冰水游泳,夾尾，晃尾，束縛刺激，噪音，閃光等刺激)的原則,以避免刺激之間的交互作用。每日采用1種刺激,平均每種刺激被采用2—3次,同種刺激不能連續(xù)出現(xiàn),使動物不能預(yù)料刺激的發(fā)生。

　　4.行為學(xué)指標(biāo)的測量

　　主要包括 1%蔗糖水消耗率、體重變化率、敞箱實驗、Morris 水迷宮實驗

　　4.1體重變化率

　　分別在實驗的第 1d、15d、22d、29、36d 、43d、50d、57、64d進行。動物體重變化率(%)=(當(dāng)日測量的體重-第1天的體重)/第1天的體重。 4.2糖水消耗實驗

　　實驗前期準(zhǔn)備，在安靜的環(huán)境內(nèi)訓(xùn)練動物適應(yīng)含糖飲水：第一個24h，每籠同時放置兩個完全相同的動物水瓶，兩瓶均為同等重量的1%蔗糖水;第二個24 h， 一瓶為1%鹿糖水,一瓶為相同重量的純凈水。然后進入實驗階段，禁水禁食24h后,測定9p.m-7a.m 10小時內(nèi)大鼠1%蔗糖水?dāng)z入量。糖水偏愛率% =糖水消耗量/(糖水消耗量+清水消耗量)X100%。適養(yǎng)期間進行三次糖水偏愛篩選,將糖水偏愛率異常的大鼠剔除,不用于正式實驗(三次糖水偏愛測試中均只喝自來水的大鼠為異常大鼠)。測定動物在實驗第1天、第22天、第49天、第64天糖水偏愛率的變化。

　　4.3 敞箱實驗

　　敞箱實驗(Open-field Test )是評價實驗動物在新異環(huán)境中自主行為、探究行為與緊張度的一種方法。以實驗動物在陌生環(huán)境中某些行為的發(fā)生頻率和持續(xù)時間來反應(yīng)實驗動物的自主行為與探究行為,以尿便次數(shù)反應(yīng)其緊張度。敞箱實驗(Open-field Test):木質(zhì)敞箱,立方形,長、寬、高為80cm x 80cm x 40cm,內(nèi)側(cè)壁、底面為黑色,底面用白線劃分為面積相等的25塊正方形。室內(nèi)安靜環(huán)境下將大鼠放置于敞箱底面的中心方格內(nèi),人距離敞箱1米之外,記錄大鼠在3 min內(nèi)活動頻率。以穿越底面正方形塊數(shù)為水平穿越格數(shù)(4爪均進入方格才記數(shù),為水平運動得分)、以兩后肢直立的次數(shù)為豎立活動次數(shù)(兩前爪騰空或攀附墻壁,為垂直運動得分),理毛次數(shù)以及大小便次數(shù)。每只動物只測1次,測定完畢后徹底清潔敞箱再進行下一只觀察。分別于實驗前1天、實驗第22天和最后1天進行。

　　4.4 Morris 水迷宮實驗

　　該實驗是對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的檢測，主要包括定位航行實驗和空間搜索實驗。實驗用主要裝置包括一個銀灰色圓形水池(直徑 150cm)，一個白色平臺(直徑10cm)，一臺跟蹤攝像機以及與攝像機相連的計算機，池內(nèi)盛水，且水溫保持在 22-24℃。最后一次敞箱實驗結(jié)束后第二天開始，首先訓(xùn)練大鼠尋找平臺，平臺置于水面下 2cm，攝像機位于水池上方約 200cm，能清晰攝取到大鼠的運動軌跡。將水池分為四個象限，將大鼠從任意一個象限放入水中，記錄其找到平臺的路徑及時間，前幾次訓(xùn)練中，若時間超過 120s，則引導(dǎo)動物到平臺，并在平臺上停留10s。然后進行定位航行與空間搜索實驗。定位航行實驗：訓(xùn)練結(jié)束后的第一天，保持平臺位置不動，將大鼠隨機從一個象限放入水中，開始記錄大鼠的運動軌跡及找到平臺的時間;空間搜索實驗：定位航行實驗結(jié)束后，將平臺撤走，將動物從原平臺位置的對側(cè)放入，開始記錄 120s 內(nèi)大鼠的運動軌跡及潛伏期與穿越平臺次數(shù)。以此做為對空間記憶能力的檢測指標(biāo)。

　　4.4 懸尾實驗

　　將實驗動物通過固定動物尾端2cm處使其頭向下懸掛，動物在該環(huán)境中拼命掙扎試圖逃跑又無法逃脫，從而提供了一個無可回避的壓迫環(huán)境，一段時間的實驗后，記錄處于該環(huán)境的動物產(chǎn)生絕望的不動狀態(tài)的時間。動物表現(xiàn)出的這種典型的“不動狀態(tài)”，反映了一種被稱之為“行為絕望狀態(tài)”，這種行為絕望模型與抑郁癥類似，而且對絕大多數(shù)抗抑郁藥物敏感，而且其藥效與臨床藥效顯著相關(guān)。

　　5.尼氏染色

　　正常的神經(jīng)細胞都含有一定數(shù)量的尼氏小體，它們主要分布于神經(jīng)細胞的漿中，形狀有大有小，如三角形，有的為橢圓形。這些物質(zhì)能被大部分的藍色染料所染色，這些染料如焦油堅牢紫(Cresyl fast violet)、亞甲藍(methylene blue)、甲苯胺藍(toluidine blue)、硫董(thionin)等將其染為藍色。但是，當(dāng)神經(jīng)細胞受傷后，胞質(zhì)內(nèi)的尼氏體更可發(fā)生變化，嚴重的可消失，通過觀察尼氏小體的數(shù)量可以探知神經(jīng)元的受損或修復(fù)情況。

　　各組大鼠分別于末次給藥后麻醉,使大鼠仰臥位固定于實驗臺上,打開腹腔,掀起右肺,在靠近脊柱處找出下腔靜脈和腹主動脈。用止血鉗夾住腹主動脈和下腔靜脈,接著打開胸腔,用針頭經(jīng)左心室插入升主動脈,后剪開右心耳,進行灌注。先用0.9%的生理鹽水250ml經(jīng)心臟快速灌注沖洗,再用4%的低聚甲醛,O.lmol/L的磷酸緩沖液(PH7.2-7.4)350ml灌注。在灌注固定液過程中后期大鼠頸部、肩部和雙前肢逐漸變硬。灌注后取大鼠全腦,10%低聚甲醛固定48-60h。以松果體為標(biāo)志物,向頭側(cè)橫向切取3段,每段厚2mm。石蠟包埋,連續(xù)切片,片厚lOpin,切片,用于尼氏染色及后期的免疫組化。

　　將腦片置于0.5%甲苯胺藍(母液：甲苯胺藍1g，無水乙醇100ml。使用時按1:1比例與新鮮的0.1%NaCl溶液混合成工作液)或焦油紫(焦油紫0.1g;蒸餾水99ml;1%冰醋酸1ml)中室溫下染色30min。在75%、95%、100%酒精中各脫色1min，二甲苯透明10min，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察照相并對尼氏染色陽性神經(jīng)元進行計數(shù)。

　　6.測量生化指標(biāo)

　　主要包括CREB、BDNF mRNA在大鼠海馬內(nèi)的表達;免疫組化檢測TrKB、ERK1/2蛋白的表達;免疫印跡法檢查CaM、CaMKⅡ的表達。

　　6.1逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測CREB、BDNFmRNA在大鼠海馬內(nèi)的表達 首先勻漿：海馬新鮮組織約100mg,加入1ml的TRIZOL試劑,用電動勾漿器進行勾漿;兩相分離:分裝后樣品于15到30℃孵育5分鐘。每1ml的TRIZOL試劑勾漿的樣品中加入0.2 ml的氯仿,蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后,15-30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000 g離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色紛氯仿相,中間層核上層的無色的水相。RNA全部被分配于水相中,水相的體積大約是勾漿時加入的TRIZO試劑的60%;RNA沉淀:將水相轉(zhuǎn)移到新離心管中。水相與異丙醇混合以沉淀其中的RNA,加入異丙醇的量為每個樣品勻漿時加入，1mlTRIZOL試劑加0.5 ml的異丙醇，混勾后15-30℃孵育10分鐘后,于4℃ 12,000g離心10分鐘;RNA清洗:移去上清液,每1mlTRIZOL試劑勻漿的樣品中加入至少1ml的75%乙醇,清洗RNA沉淀。振蕩后,4℃，7500g離心5分鐘;重新溶解RNA況淀:去除乙醇溶液,空氣中干燥RNA沉淀5-10分鐘,切勿真空離心干燥，注意RNA沉淀不要完全干燥,否則將大大降低RNA的可溶性，部分溶解的RNA樣品A260/280比值將小于1.6;溶解RNA時,先加入無RNA酶的水用槍反復(fù)吹打幾次,然后55-60℃孵育10分鐘。莰得的RNA溶液保存于-70℃;濃度測定:取少量液體用TE稀釋(一般1: 100稀釋)后,讀取其在紫外分光光度計260nm和280nm處的吸收值,A260下讀值為1表示40ugRNA/ml;樣品RNA濃度(ug/ml)=A260×稀釋倍數(shù)40ug/ml;RNA純度檢測:RNA溶液的A260/A280的比值范圍應(yīng)在1.8-2.1之間;

　　在無核酸酶的離心管中配制反應(yīng)液： RNA，1-5μg;逆轉(zhuǎn)錄引物 (20um)，1μl;RNase free H2O，使總體系為12.5μl(反應(yīng)液配制在冰上進行)。輕輕混勻,65℃變性10min，立即置于冰上2min后加入：RNA-primer mix，12.5μl;5×RTReaction Buffer ，4μl;dNTP(10mM)，2μl;RiboLock RNase Inhibitor ，0.5μl;RevertAid Reverse Transcriptase，1μl。總體系20μl，25℃孵育10min后42℃孵育60min，70℃ 加熱滅活10 min，-20℃保存。 設(shè)計相應(yīng)的引物，配制成合適濃度工作液，Real time-PCR儀反應(yīng)體系液配制：2X all-in-OneTM qPCR Mix(含ROX)，10μl;引物(10pmol/μl)，上下游各0.4μl;ddH2O，4.2μl;cDNA(適度稀釋) ，5μl?？傮w系20μl。反應(yīng)條件：95℃，10min,以下反復(fù)40個循環(huán);95℃,10s;60℃，20s;72℃，20s。最后結(jié)果采用2-ΔΔCT法進行測量。

　　6.2免疫組化法檢測TrKB、ERK1/2的表達

　　切片后,常規(guī)脫蠟至水;3%過氧化氫孵育lOmin,可以滅活內(nèi)源性酶的活性,蒸水沖洗,5minx3次;微波熱修復(fù)3min,PBS沖洗,5minx3次;滴加5%BSA封閉液,室溫孵育30min;滴加一抗,5-HTiaR 一抗稀釋為1:50,PKA稀釋為1:100,CREB稀釋為1:100,4°C過夜,PBS沖洗,5minx3次;滴加二抗生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG,37°C孵育30min,PBS沖洗,5minx3次;滴加三抗試劑SABC,37°C孵育30min,PBS沖洗,5minx3次;DAB顯色劑顯色,室溫下15inin,蒸饋水沖洗,脫水,透明,封片最后DAB 顯色劑顯色，室溫下20min，蒸餾水終止反應(yīng)，常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。每只動物取相同部位的3張切片，每張切片選取3個視野，在同一放大倍數(shù)、同一光強度下，采用CMLAS 彩色病理圖像分析系統(tǒng)，分別計算每張切片中海馬組織TrKB、ERK1/2表達的平均光密度。

　　6.3免疫印跡法測定鈣調(diào)素(CaM)、鈣調(diào)蛋白激酶(CaMKⅡ)蛋白表達變化

　　取新鮮海馬約100mg置1.5mlEP管中，生理鹽水沖洗兩遍，充分剪碎，離心去上清。每管加4℃裂解液1ml，繼續(xù)剪碎、混勻，低溫超聲勻漿;14000轉(zhuǎn)離心，5min，取上清備用。取上清5μl，加考馬斯亮藍3μl，去離子水95μl，595nm 處，1cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管OD值;根據(jù)樣品OD值調(diào)整蛋白濃度。樣品煮沸5min，冷卻后取50μg上樣;電件(12%濃縮膠：90v30min;10%分離膠：120v120min);NC膜轉(zhuǎn)印(70v120min);5%脫脂奶粉TBST溶液封閉抗體，搖床2h，TBS漂洗5min，3次。一抗孵育(兔抗人CaM、CaMKⅡ多克隆抗體1:500稀釋)，4℃過夜;二抗孵育(辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG 1:1500稀釋)，37℃ 1h;掃描并分析結(jié)果，條件設(shè)置為曝光2min，CCD自動獲取圖像，同時以1:1000稀釋的小鼠抗大鼠beta-actin單克隆抗體作為內(nèi)參照，各蛋白相對表達量以相應(yīng)蛋白/beta-actin灰度值表示。

　　九 課題創(chuàng)新性

　　1. 本課題首次系統(tǒng)地由宏觀到微觀地進行綜合研究，能從行為學(xué)水平→細胞形態(tài)水平→分子水平三個層次經(jīng)行分析，以期待比較完善地探索百合知母湯抗抑郁功效及其機理。

　　2. 本課題選用了先進的指標(biāo)，并且采用蛋白水平和mRNA水平檢測方法，檢測神經(jīng)營養(yǎng)因子及相關(guān)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵因子的變化，以期探尋本方提高抑郁癥大鼠腦組織CREBmRNA的表達水平的進一步信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。

　　十 預(yù)期結(jié)果

　　1. 成功完成大鼠抑郁癥CUMS模型的建立，構(gòu)建良好的實驗平臺。

　　2. 探討百合知母湯抗抑郁機制中三種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)揮的作用，篩選百合知母湯抗抑郁的靶點通路。

　　3. 預(yù)計在國內(nèi)學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表論文2篇。

　　參考文獻

　　[1]吳炫靜. 抑郁癥的中醫(yī)辨證治療研究[D].北京：中國中醫(yī)科學(xué)院. 2008:15-23.

　　[2]孫旭海.中醫(yī)精神疾病分類與癥狀的古代醫(yī)學(xué)文獻整理研究[D].北京:中國中醫(yī)科學(xué)院. 2007: 1-2.

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　　中醫(yī)學(xué)開題報告篇三：

　　研究背景及意義

　　研究背景

　　隨著醫(yī)療衛(wèi)生體制改革的進一步深入，醫(yī)院的經(jīng)營模式及所有制形式正處在變革當(dāng)中，醫(yī)院國家、集體、個體等多種所有制并存的形式代替了原來單一的國家所有，國有醫(yī)院的經(jīng)營模式和運行方式也在朝著適應(yīng)市場運作規(guī)律的方向發(fā)展，醫(yī)院必將面臨日益激烈的競爭。

　　在新形勢下，隨著國家衛(wèi)生改革政策的不斷推進，醫(yī)療市場的競爭迫使醫(yī)院必須抓管理，講效益，運用營銷策略[1]。關(guān)于醫(yī)院營銷論文開題報告，因此，醫(yī)院管理者要轉(zhuǎn)變觀念，運用現(xiàn)代營銷學(xué)的觀點，通過營銷手段樹立良好的醫(yī)院品牌形象，提高競爭力，更好地滿足廣大人民群眾對醫(yī)療服務(wù)的多層次需求，根據(jù)我國衛(wèi)生事業(yè)的性質(zhì)，借鑒國內(nèi)服務(wù)行業(yè)市場營銷和國外醫(yī)院市場營銷的成功經(jīng)驗，并結(jié)合我國的國情，建立一套適合中國醫(yī)院發(fā)展的市場營銷模式。

　　近幾年來，國內(nèi)大部分醫(yī)院開始有市場營銷的意識，開展了一些諸如廣告、傳播、服務(wù)措施優(yōu)質(zhì)化與多樣化的操作。但由于缺乏系統(tǒng)的營銷理論和實操經(jīng)驗，許多操作還很不規(guī)范，使醫(yī)院的市場營銷工作很難有針對性，其結(jié)果是醫(yī)院在制定競爭策略時大多沒有體現(xiàn)差異，缺乏個性，形不成自身的核心競爭力。

　　湖南省中醫(yī)院是一所有著 7余年歷史的省級中醫(yī)名院。素有 湖湘中醫(yī)發(fā)祥地 三湘名醫(yī)之搖籃 譽稱。屬國家三級甲等中醫(yī)醫(yī)院，是省內(nèi)集醫(yī)療、保健、教學(xué)、科研于一體的中醫(yī)龍頭醫(yī)院之一。

　　擁有 17 個中醫(yī)特色專科和 5個中醫(yī)?？茖２￠T診，其中 4 個國家重點專科、6 個湖南省重點?？?。開放病床 606 張。醫(yī)院正在著手修建一棟 28 層醫(yī)療教學(xué)綜合大樓，大樓建成后將增加病床 100張最新醫(yī)學(xué)論文開題報告模板精選3篇最新醫(yī)學(xué)論文開題報告模板精選3篇。湖南省中醫(yī)院歷史悠久、名醫(yī)薈萃、中醫(yī)特色濃郁、?？茖２〗ㄔO(shè)突出。但醫(yī)院身居鬧市，周邊醫(yī)院林立，市場競爭激烈 。因此，正視服務(wù)營銷在醫(yī)院發(fā)展中的作用，提升醫(yī)院的知名度和美譽度，提高醫(yī)院的市場占有率，讓更多的病友享受到中醫(yī)簡便廉驗的預(yù)防與治療，是當(dāng)前一個亟需思考、比較迫切的問題;如何利用服務(wù)營銷的系統(tǒng)理論，對湖南省中醫(yī)院進行服務(wù)營銷策略研究顯得迫在眉睫。

　　選題意義

　　新時期，醫(yī)療機構(gòu)的改革和醫(yī)療市場的競爭給醫(yī)院的發(fā)展帶來了機遇，同時也帶來了挑戰(zhàn)。在充滿競爭的市場經(jīng)濟中，醫(yī)院管理者已經(jīng)開始意識到營銷的重要性，重視醫(yī)院營銷活動，但當(dāng)前許多醫(yī)院，由于其特定的專業(yè)性、技術(shù)性，缺乏整體的市場營銷理念和理論，沒有充分發(fā)揮營銷在醫(yī)院發(fā)展中的重要作用。

　　研究思路與基本框架

　　關(guān)于醫(yī)院營銷論文開題報告，論文主要包括以下五個部分的內(nèi)容：第一章緒論。介紹本文的研究背景、研究的方法以及對醫(yī)院服務(wù)營銷、醫(yī)療服務(wù)消費者研究、服務(wù)質(zhì)量理論、關(guān)系營銷理論、內(nèi)部營銷理論。

　　第二章運用波特五力模型、SWOT 分析法等對湖南省中醫(yī)院服務(wù)營銷內(nèi)外部環(huán)境進行深入分析。

　　第三章通過對湖南省中醫(yī)院市場進行細分，對其目標(biāo)市場選擇和定位進行深入研究。

　　第四章是在前文分析研究的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)而又有重點的分析和制定醫(yī)院服務(wù)產(chǎn)品、服務(wù)價格、服務(wù)渠道、服務(wù)促銷、服務(wù)人員、服務(wù)過程、有形展示等要素的具體應(yīng)用策略。

　　第五章是提出實施湖南省服務(wù)營銷策略的保障措施。

　　最后對本文進行總結(jié)。