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　　PCR技術(shù)的研究與現(xiàn)狀分析篇一

　　摘要：PCR技術(shù)是一種體外酶促合成、擴(kuò)增特定DNA片段的方法。因其高強(qiáng)的特異性和靈敏度以及檢測速度快、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于水產(chǎn)、微生物檢測、臨床微生物、基因表達(dá)、腫瘤免疫、微小殘留病變的檢測，DNA拷貝數(shù)的測量、基因組變異和多態(tài)性等許多方面。本文主要介紹4種PCR技術(shù)及其在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀。 關(guān)鍵詞：PCR技術(shù);分類;研究現(xiàn)狀;應(yīng)用;

　　Research and Application Status of PCR Technology

　　Class 1 Bio-engineering 10 Student: Lao Yangyan Student ID: 1031250019 Tutor: Wei Dongmei Abstract: PCR is an in vitro enzymatic synthesis，amplification of specific DNA fragment. Because of its high-strength specificity and sensitivity，detection speed and good accuracy，it has been widely applied in many fields such as the aquatic，microbial detection，clinical

　　microbiology，gene expression，tumor immunology，detect ion of minimal residual lesion，measurement of DNA copy number，genome mutation，polymorphism and so on. This article summarize 4 kinds of PCR technology，with its application status is analysed.

　　Keywords: PCR technology;Category;Progress research;Application

　　引言

　　聚合酶鏈反應(yīng)( PCR) 技術(shù)問世20多年以來, 已經(jīng)在生物學(xué)研究領(lǐng)域內(nèi)得到了巨大的發(fā)展并不斷的完善, 不僅廣泛應(yīng)用在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域, 在疾病診斷等方面也有了越來越廣泛深入的研究和應(yīng)用。1985年，美國Karray等學(xué)者首創(chuàng)了PCR 技術(shù)，并且由美國Cetus 公司開發(fā)研制[1]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和突破，PCR 技術(shù)已在多個(gè)領(lǐng)域得到廣泛地應(yīng)用，如微生物檢測、獸醫(yī)學(xué)、水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面。由于該技術(shù)具有較強(qiáng)的靈敏度、準(zhǔn)確度和特異性，又能快速進(jìn)行檢測，因而其應(yīng)用領(lǐng)域也在不斷延伸[2]。隨著PCR 技術(shù)的不斷發(fā)展，在常規(guī)PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上又衍生出了許多技術(shù)，如多重PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、單分子PCR 技術(shù)、變性梯度凝膠電泳技術(shù)。目前應(yīng)用最多的為熒光定量。本文主要介紹4種PCR技術(shù)及其在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀。并對PCR的前景進(jìn)行了展望，讓其更好的服務(wù)于人們的生活。 1 PCR技術(shù)原理

　　PCR 技術(shù)是根據(jù)待擴(kuò)增的已知DNA片段序列、人工合成與該DNA 2條鏈末端互補(bǔ)的2段寡核苷酸引物，在體外將待檢DNA序列(模板)在酶促作用下進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 的整個(gè)技術(shù)過程經(jīng)若干個(gè)循環(huán)組成，一個(gè)循環(huán)包括連續(xù)的3個(gè)步驟：第1步是高溫條件下的DNA模板變性，即模板DNA在93~94℃的條件下變性解鏈;第2步是退火，即人工合成的2個(gè)寡核苷酸引物與模板DNA鏈3’端經(jīng)降溫至55℃退火;第3步是延伸，即在4種dNTP底物同時(shí)存在的情況下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物鏈將沿著5’-3’方向延伸與模板互補(bǔ)

　　的新鏈[3]。經(jīng)過這個(gè)循環(huán)后，合成了新鏈，可將其作為DNA模板繼續(xù)反應(yīng)，由此循環(huán)進(jìn)行。循環(huán)進(jìn)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的量以指數(shù)方式增加，一般單一拷貝的基因循環(huán)25~30次，DNA可擴(kuò)增l00 ~200萬倍。PCR反應(yīng)的步驟很簡單，但是具體的操作是復(fù)雜的，如退火溫度的確定、延伸時(shí)間的長短以及循環(huán)數(shù)等。因此，不同的反應(yīng)體系應(yīng)該確定適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件，以避免假陰性或假陽性等情況的產(chǎn)生。

　　2 PCR技術(shù)的分類

　　在傳統(tǒng)PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上，根據(jù)人們的需要以及各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用要求，又衍生出很多種類的PCR 技術(shù)。新技術(shù)在各領(lǐng)域廣泛應(yīng)用并逐漸改進(jìn)，為進(jìn)一步的研究提供了基礎(chǔ)。

　　2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

　　1996 年，學(xué)者經(jīng)過研究，在傳統(tǒng)PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上，首創(chuàng)了實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)，新技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用至醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、分子生物學(xué)和其他基礎(chǔ)研究領(lǐng)域。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)基于傳統(tǒng)技術(shù)的優(yōu)勢，還具有實(shí)時(shí)性、準(zhǔn)確性、無污染，實(shí)現(xiàn)了自動化操作和多重反應(yīng)，是PCR 技術(shù)研究史上從定性到定量的飛躍[4]。熒光定量PCR 技術(shù)最大的特點(diǎn)是能將熒光基團(tuán)加入到PCR 反應(yīng)體系中，借助于熒光信號，累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析[5]。實(shí)時(shí)監(jiān)測這一特點(diǎn)是常規(guī)PCR 技術(shù)所不具有的，因?yàn)槠鋵U(kuò)增反應(yīng)不能進(jìn)行隨時(shí)的檢測。常規(guī)PCR 技術(shù)的擴(kuò)增終產(chǎn)物需要在凝膠電泳等條件下才能進(jìn)行，無法對起始模板進(jìn)行準(zhǔn)確的定量，而熒光定量PCR 技術(shù)的反應(yīng)進(jìn)程可以根據(jù)熒光信號的變化做出準(zhǔn)確的判斷[6]。一個(gè)PCR 循環(huán)反應(yīng)結(jié)束之后，定量PCR 儀可以收集1個(gè)熒光強(qiáng)度信號，熒光信號強(qiáng)度的變化可以反映產(chǎn)物量的變化情況，這樣就可以得到1條熒光擴(kuò)增曲線[7]。熒光信號在指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR 產(chǎn)物熒光信號的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性對應(yīng)關(guān)系，然后進(jìn)行定量分析[8]。

　　2.2 多重PCR 技術(shù)

　　多重PCR(mutiplex PCR)技術(shù)是PCR 技術(shù)的一種，為同一管中加入多對特異性引物，與PCR 管內(nèi)的多個(gè)模板反應(yīng)，在一個(gè)PCR 管中同時(shí)檢測多個(gè)目標(biāo)DNA分子。多重PCR技術(shù)可以擴(kuò)增一個(gè)物種的一個(gè)片段，也可以同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)物種的不同片段[9]。在同一反應(yīng)體系中，多重PCR 技術(shù)進(jìn)行多個(gè)位點(diǎn)的特異性擴(kuò)增時(shí)，引物間的配對、引物間的競爭性擴(kuò)增等會對擴(kuò)增效果產(chǎn)生重要影響。一方面，如果能選擇適宜的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，可極大地提高多重PCR 的擴(kuò)增效果[10]。主要包括退火溫度、退火及延伸時(shí)間、PCR 緩沖液成分、dNTP 的用量、引物及模板的量等。另一方面，DNA的抽提質(zhì)量也影響多重PCR 擴(kuò)增效率，如DNA抽提不干凈或降解都將影響PCR 擴(kuò)增效果[11]。

　　2.3 單分子PCR 技術(shù)(SM-PCR)

　　單分子PCR 技術(shù)是在傳統(tǒng)PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展的，基本循環(huán)過程相同，但在反應(yīng)條件、模板數(shù)量、DNA聚合酶選擇、引物設(shè)計(jì)方面具有不同點(diǎn)。該技術(shù)是以少量或單個(gè)DNA分子為模板進(jìn)行的PCR[12]。單分子PCR 技術(shù)反應(yīng)中，DNA模板濃度極低，這就要求模板有較高的質(zhì)量。因?yàn)檫@是試驗(yàn)成敗的決定性因素。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，應(yīng)該嚴(yán)格控制GC 的含量和Tm值，同時(shí)盡量避免引物間存在可配對序列。在反應(yīng)混合物模板數(shù)極低的情況下，若引物之間存在少量配對序列，擴(kuò)增時(shí)極易形成二聚體，使反應(yīng)無法進(jìn)行，得不到所需要的產(chǎn)物[13]。由于單分子PCR 技術(shù)反應(yīng)的變性溫度(96~98 ℃)大多比常規(guī)PCR 技術(shù)(94 ℃)略高，因而對DNA聚合酶熱穩(wěn)定性的要求也更加嚴(yán)格，需要有較好的熱穩(wěn)定性，以防止溫度過高而使其失活。其變性時(shí)間(5~15 s)、退火時(shí)間及延伸時(shí)間也短于常規(guī)PCR技術(shù)。

　　2.4 變性梯度凝膠電泳PCR技術(shù)(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

　　PCR-DGGE 技術(shù)是基于核酸序列的不同，將片段大小相同的DNA序列分開的一種技術(shù)方法[14]。在進(jìn)行變性梯度凝膠電泳時(shí)，序列不同的DNA片段因?yàn)閴A基組成和排列的差異，在聚丙烯酰胺凝膠中解鏈時(shí)需要不同的變性劑濃度，并會發(fā)生空間構(gòu)型的變化，最終導(dǎo)致電泳遷移率的差異。將通過PCR擴(kuò)增之后得到的等長雙鏈DNA分子，在含梯度變性劑( 如尿素、甲酰胺) 的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳時(shí)，電泳遷移率的差異會使不同序列的DNA片段停留在凝膠的不同位置，從而形成相互分開的條帶圖譜[15]。從理論上講, 只要選擇的電泳條件足夠精細(xì), 就可以分開僅有1個(gè)堿基差異的DNA片段[ 16]。

　　3 PCR技術(shù)的應(yīng)用

　　3.1 PCR技術(shù)在水產(chǎn)上的應(yīng)用

　　基因表達(dá)是檢測某個(gè)基因在不同發(fā)育期或不同組織中的表達(dá)量變化，或受到某種試驗(yàn)處理過程中的影響而出現(xiàn)表達(dá)量變化的情況。有學(xué)者應(yīng)用real-time PCR 技術(shù)研究碳水化合物含量對翹嘴紅鲴糖代謝酶G6Pase、GK 以及PEPCK表達(dá)量的影響[17]，研究結(jié)果可為翹嘴紅鲴飼料配方中的最合適糖含量提供理論依據(jù)[18]。孫淑娜等研究葉酸拮抗劑對斑馬魚心臟發(fā)育相關(guān)基因BMP2b及HAS2表達(dá)的影響，表明葉酸拮抗劑對早期胚胎的心臟發(fā)育影響較大，可導(dǎo)致斑馬魚心臟發(fā)育延遲及心臟形態(tài)異常，并下調(diào)斑馬魚心臟發(fā)育相關(guān)基因BMP2b 及HAS2 的表達(dá)，這可能是葉酸生物學(xué)活性受抑后導(dǎo)致心臟發(fā)育異常的機(jī)制之一。Sawyer et al以斑馬魚的未受精卵、胚胎、仔魚和成魚為研究材料，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)，檢測了P450aromA和P450aromB 在不同組織的表達(dá)量，表明在各組織中均有2種基因的表達(dá)，但表達(dá)量顯著不同，呈現(xiàn)組織特異性。

　　3.2 PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光探針，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR 從定性到定量的飛躍，除了具有常規(guī)PCR的快速、靈敏、操作方便等特點(diǎn)外，還具有以下優(yōu)點(diǎn)：全封閉反應(yīng)，無需凝膠電泳等PCR后處理，減小對環(huán)境的污染;不使用有毒試劑，操作安全;定量準(zhǔn)確;儀器在線實(shí)時(shí)監(jiān)測，結(jié)果直觀。

　　多重PCR技術(shù)是通過對普通PCR技術(shù)的改進(jìn)而建立起來的一種技術(shù)，是將多條引物和多條模板混合在一個(gè)反應(yīng)體系中分別特異擴(kuò)增不同的目的條帶，或者多條引物和單一的模板DNA混合在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增同一模板的不同片斷，常用于對超長片斷的擴(kuò)增。與常規(guī)的PCR相比，還具有擴(kuò)增效率高、產(chǎn)物特異性高和經(jīng)濟(jì)簡便等特點(diǎn)，特別適合食品中多種致病菌的快速檢測。

　　PCR-DGGE技術(shù)具有可檢測不可培養(yǎng)類細(xì)菌、檢測時(shí)間短、檢測率高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。近些年來，此技術(shù)在食品中檢測微生物后應(yīng)用也有報(bào)道。

　　3.3 PCR技術(shù)在臨床微生物中的應(yīng)用

　　許多傳染病的特點(diǎn)是具有高度的變異率，這會嚴(yán)重影響對致病菌的評估，分子信標(biāo)可以用于病原菌的定量。它的優(yōu)點(diǎn)是: 一個(gè)沒有熒光的淬滅物可以用于4個(gè)不同的熒光染料， 這樣就可以同時(shí)檢測和定量4個(gè)樣本。在許多應(yīng)用領(lǐng)域需要同時(shí)對多個(gè)核酸進(jìn)行定量， 這將大大降低檢測的花費(fèi)和所需的時(shí)間。這個(gè)方法的另一個(gè)好處在于加樣的誤差被最小化了， 而且所有核酸都是在相同的條件下同時(shí)擴(kuò)增， 這樣它所獲得的數(shù)據(jù)就更加精確可靠。當(dāng)然， 多通道檢測比單通道檢測更為復(fù)雜也需要解決可能出現(xiàn)的更多問題。廣東省花都市人民醫(yī)院、中山醫(yī)科大學(xué)基因診斷中心采用熒光定量PCR 檢測技術(shù)對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒等5個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行了定量測定， 結(jié)果表明定量PCR方法可靠性和重復(fù)性好，且操作簡便、快速，結(jié)果判斷客觀。除此以外，目前已有用此方法對人類免疫缺陷病毒，肝炎病毒，結(jié)核桿菌，巨細(xì)胞病毒，EB病毒，流感病毒A、B等病原體進(jìn)行檢測的報(bào)道。

　　3.4 PCR技術(shù)在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用

　　家育DNA多態(tài)性研究是近年來興起的分子水平遺傳標(biāo)記選擇技術(shù), 對于開展品種問遺傳差異程度、種群間親緣關(guān)系、個(gè)體問遺傳相似性, 親子鑒定等方面的工作, 對于開展數(shù)量性狀的間接選擇, 早期選擇, 提高數(shù)量性狀選擇效率等研究均具有重要的意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。PCR技術(shù)的出現(xiàn)大大推動了上述研究的進(jìn)程。以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的DNA多態(tài)性分析和檢測技術(shù), 如PCR-RFLP(限制性長度多態(tài)性) , PCR-SSCP (多聚酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的單鏈構(gòu)象多態(tài)性) 和AFLP(擴(kuò)增片斷長度多態(tài)性)等, 已經(jīng)在豬DNA多態(tài)性研究中得到了應(yīng)用, 并且有可能迅速推廣到育種實(shí)踐中去。

　　3.5 PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測中的應(yīng)用

　　轉(zhuǎn)基因食品，是利用基因工程技術(shù)將有利的基因轉(zhuǎn)移到微生物,，植物或動物細(xì)胞內(nèi)，使他們獲得有利的特性，再由這些轉(zhuǎn)基因物種生產(chǎn)或處理獲得的食品及添加劑。由此可增加食品的種類，提高產(chǎn)量，改進(jìn)營養(yǎng)成分的構(gòu)成，延長貨架期等，目前，轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的安全性問題越來越引起消費(fèi)者的重視[25]。為了保護(hù)人類的健康，世界衛(wèi)生組織在20世紀(jì)90年代提出了對轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行安全性評價(jià)的要求，對食品中的GMOs存在與否進(jìn)行標(biāo)示。因此，對食品中的GMOs 進(jìn)行監(jiān)測，建立安全性檢驗(yàn)的技術(shù)與方法，成為管理和審批工作的重要基礎(chǔ)。在眾多的監(jiān)測方法中，PCR 是最常用以及最適用的監(jiān)測轉(zhuǎn)基因食品的方法。PCR 方法中，常用的幾個(gè)特定序列分為三類：

　　1、調(diào)控序列：他們調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)入植物的基因的表達(dá)。由于大多數(shù)轉(zhuǎn)基因食品的基因都含有CaMV 35S 啟動子和NOS 終止子，因此，在檢測食品中是否含有GMOs 時(shí)，可以直接檢測CaMV 35S 啟動子和/或NOS 終止子的存在與否，如果存在，即可說明其中存在GMOs。

　　2、標(biāo)記序列，用于幫助在遺傳轉(zhuǎn)化中篩選和鑒定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，組織和再生植株，一般是抗生素抗性基因。

　　3、目的基因，即轉(zhuǎn)入的基因，如抗蟲、抗除草劑基因。用PCR 方法鑒定植株中檢出的目的基因，標(biāo)記基因，報(bào)告基因，35S，NOS 等外源基因片段，為轉(zhuǎn)基因食品的篩選鑒定及為安全性評價(jià)提供敏感直接的數(shù)據(jù)，成為轉(zhuǎn)基因食品安全性檢驗(yàn)中一項(xiàng)重要的技術(shù)手段。 4 PCR技術(shù)的應(yīng)用前景展望

　　傳統(tǒng)PCR技術(shù)以及衍生出來的新型PCR技術(shù)自面世以來，已被廣泛應(yīng)用到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。隨著技術(shù)方法的不斷改進(jìn)與完善，熒光定量PCR技術(shù)將會逐漸完善并廣泛應(yīng)用;多重PCR技術(shù)在食品病原微生物、非致病微生物及環(huán)境微生物檢測中將具有重要作用。未來的研究主要集中在去除食品抑制因子干擾、改進(jìn)樣品前處理技術(shù)等方面。

　　隨著研究的不斷深入發(fā)展與完善，許多相關(guān)的新類型及改良的PCR技術(shù)將會不斷涌現(xiàn)，這些派生出的新類型和新方法必將在未來食品檢測中有非常好的應(yīng)用前景。

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　　生生物學(xué)報(bào), 2008, 32(1): 47-53.

　　pcr技術(shù)論文篇二

　　摘要：PCR技術(shù)又稱無細(xì)胞分子克隆系統(tǒng)或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增法，是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期,循環(huán)進(jìn)行,使目的DNA得以迅速擴(kuò)增,具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、省時(shí)等特點(diǎn)，是基因擴(kuò)增技術(shù)的一次重大革新。PCR技術(shù)可將極微量的靶DNA特異地?cái)U(kuò)增上百萬倍，從而大大提高對DNA分子的分析和檢測能力，能檢測單分子DNA或?qū)γ?0萬個(gè)細(xì)胞中僅含1個(gè)靶DNA分子的樣品，因而此方法立即在分子生物學(xué)、微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及遺傳學(xué)等多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用和迅速發(fā)展。 關(guān)鍵詞：PCR原理、PCR過程及應(yīng)用、關(guān)于PCR技術(shù)要點(diǎn)

　　1、PCR技術(shù)的基本原理

　　DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。

　　PCR的過程類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火(復(fù)性)--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右維持一定時(shí)間，使含有所需擴(kuò)增分析序列的靶DNA雙鏈經(jīng)熱變性處理解開為兩個(gè)寡聚核苷酸單鏈，然后加入一對根據(jù)已知DNA序列由人工合成的與所擴(kuò)增的DNA兩端鄰近序列互補(bǔ)的寡聚核苷酸片段作為引物，即左右引物。此引物范圍就在包括所欲擴(kuò)增的DNA片段，一般需20-30個(gè)堿基對，過少則難保持與DNA單鏈的結(jié)合;②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合;③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以4種三磷酸脫氧核苷(dNTP)為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，按5'到3'方向?qū)⒁镅由臁⒆詣雍铣尚碌腄NA鏈、使DNA重新復(fù)制成雙鏈。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”， 每次循環(huán)延伸的模板又增加1倍，亦即擴(kuò)增DNA產(chǎn)物增加1倍，經(jīng)反復(fù)循環(huán)，使靶DNA片段指數(shù)性擴(kuò)增。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。

　　2、PCR技術(shù)的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

　　(一)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：

　　10×擴(kuò)增緩沖液 10ul

　　4種dNTP混合物 各200umol/L

　　引物 各10～100pmol

　　模板DNA 0.1～2ug

　　Taq DNA聚合酶 2.5u

　　2+ Mg 1.5mmol/L

　　加雙或三蒸水至 100ul

　　(二)PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg

　　(1)引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。

　　設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：

　?、僖镩L度： 15-30bp，常用為20bp左右。

　　②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。

　?、垡飰A基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

　　④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3’端的互補(bǔ)，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。

　?、菀?’端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。

　?、抟镏杏谢蚰芗由虾线m的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對酶切分析或分子 克隆很有好處。

　?、咭锏奶禺愋裕阂飸?yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。

　?、嘁锪浚?每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會。

　　(2)酶及其濃度。目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2。5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。

　　(3)dNTP的質(zhì)量與濃度。dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝， -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg結(jié)合，使游離的Mg濃度降低。

　　(4)模板(靶基因)核酸。模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，2+2+2+消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

　　(5)Mg濃度。Mg對PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。

　　(三)PCR反應(yīng)條件的選擇：

　　PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。

　　溫度與時(shí)間的設(shè)置：基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100～300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。

　?、僮冃詼囟扰c時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時(shí)間，但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會導(dǎo)致PCR失敗。

　?、谕嘶?復(fù)性)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

　　Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)+2(A+T)

　　復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)

　　在Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。

　?、垩由鞙囟扰c時(shí)間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：

　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子

　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子

　　高于90℃時(shí)， DNA合成幾乎不能進(jìn)行。

　　PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min是足夠的3～4kb的靶序列需3～4min;擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長些。 2+2+2+2+循環(huán)次數(shù)的設(shè)置：循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。

　　3、PCR反應(yīng)的基本步驟

　　標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步：

　　1。DNA變性(90℃-96℃)：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

　　2。退火(復(fù)性)(25℃-65℃)：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

　　3。延伸(68℃-75℃)：在Taq酶(在72℃左右最佳的活性)的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。

　　每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍?，F(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行，以減少一次升降溫過程，提高了反應(yīng)速度。

　　4、PCR技術(shù)的應(yīng)用

　　PCR技術(shù)自1985年建立以來,發(fā)展之迅速,應(yīng)用之廣泛,表明其具有強(qiáng)大的生命力。近些

　　年來,基于PCR的基本原理,許多學(xué)者充分發(fā)揮創(chuàng)造性思維,對PCR技術(shù)進(jìn)行研究和改進(jìn),使PCR技術(shù)得到了進(jìn)上步地完善,并在此基礎(chǔ)上派生出了許多新的用途。

　　反向PCR 反向PCR是用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的未知序列的片段,而常規(guī)PCR擴(kuò)增的是已知序列的兩引物之間DNA片段。實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇已知序列內(nèi)部沒有切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶對該段DNA進(jìn)行酶切,然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環(huán)化連接,再用一對反向的引物進(jìn)行PCR,其擴(kuò)增產(chǎn)物將含有兩引物外未知序列,從而對未知序進(jìn)行分析研究。

　　不對稱PCR 不對稱PCR是用不等量的一對引物,PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生大量的單鏈DNA(SSDNA)。這對引物分別稱為非限制引物與限制性引物,其比例一般為50～100:1。在PCR反應(yīng)的最初10～15個(gè)循環(huán)中,其擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA,但當(dāng)限制性引物(低濃度引物)消耗完后,非限制性引物(高濃度引物)引導(dǎo)的PCR就會產(chǎn)生大量的單鏈DNA。不對稱PCR的關(guān)鍵是控制限制性引物的絕對量,需多次摸索優(yōu)化兩條引物的比例。還有一種方法是先用等濃度的引物PCR擴(kuò)增,制備雙鍵DNA,(dsDNA),然后以此dsDNA為模板,再以其中的一條引物進(jìn)行第二次PCR,制備ssDNA。不對稱PCR制備的ssDNA,主要用于核酸序列測定。

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