單克隆抗體技術(shù)論文(2)
單克隆抗體技術(shù)論文
單克隆抗體技術(shù)論文篇二
抗CLCN5單克隆抗體的制備及鑒定
[摘要] 目的：制備抗氯離子通道蛋白5(CLCN5)單克隆抗體(mAb)并對(duì)其進(jìn)行鑒定。方法：用人CLCN5為抗原免疫BLAB/c小鼠，用常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)篩選及克隆化建立可穩(wěn)定分泌抗CLCN5 mAb的雜交瘤細(xì)胞株;用ELISA及Western blot進(jìn)行抗體的鑒定。結(jié)果：篩選到4株可穩(wěn)定分泌抗CLCN5 mAb的細(xì)胞株;Western blot顯示，在4株抗體中有1株在相對(duì)分子量為83 kDa處出現(xiàn)1條特異性條帶，說(shuō)明該單克隆抗體可與HSG胞漿蛋白中的CLCN5蛋白特異性地結(jié)合。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功獲得1株可特異性識(shí)別CLCN5的單克隆抗體細(xì)胞株，可用于腎結(jié)石、X-連鎖綜合征的進(jìn)一步研究、臨床診斷及相關(guān)試劑盒等的開(kāi)發(fā)研制。
[關(guān)鍵詞] 氯離子通道蛋白(CLCN5);單克隆抗體;抗體鑒定;細(xì)胞融合
[中圖分類號(hào)] R392-33[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1673-7210(2008)01(a)-014-02
Preparation and identification of the monoclonal antibodies against chloride channel 5
CHEN Li, SHI Zhi-hua
(The Third People’s Hospital of Dalian City, Dalian116000，China)
[Abstract]Objective:To prepare and identify monoclonal antibody against chloride channel 5 (CLCN5) . Methods:We prepared hybridoma cell lines secreting CLCN5 mAb from immunized BALB/c mice with antigen CLCN5, then by cell fusion, screened with indirect ELISA and cloned with limited dilution methods. The properties of antiserum against CLCN5 were characterized by ELISA and Western blot. Results:Four hybridoma cell lines secreting CLCN5 mAb had been developed, and the ELISA titre of the mAbs was respectively detected. According to the Western blot，we could see that the CLCN5 protein was highly expressed with a molecular weight of 83 kDa, it meaned that the monoclonal antibodies specially recognized a protein band expressed in the human submandibular gland(HSG) cell line. Conclusion:We gets a CLCN5 mAb which can be specially recognized by CLCN5. The successful generation monoclonal antibodies protein will provide efficient affinity reagents for the further functional studies of clcn5 gene expressed in human body and it's relation with kidney stone dent's disease and X-linked disorder.
[Key Words] Chloride channel 5; Monoclonal antibody; Identification of the antibodies; Cell fusion
氯離子通道(CLC)是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一電壓門控氯離子通道，在細(xì)胞興奮性調(diào)節(jié)、細(xì)胞容積調(diào)節(jié)和跨上皮物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等生理過(guò)程的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。氯離子通道蛋白5(chloride channel 5, CLCN5)是其眾多分類中的一類，在核內(nèi)體上參與腎臟細(xì)胞的胞飲作用，分子量為83.152 kDa。氯離子通道蛋白基因5(clcn5)有13個(gè)外顯子，位于X染色體短臂(Xp11.22)，在腎臟、血管、胰腺、胎盤中均有表達(dá)，但以腎臟為主。在西方國(guó)家，12%的男性和5%的女性被腎結(jié)石疾病困擾，45%的病人有家庭史，且通常與高鈣尿相關(guān)，異常高鈣尿性腎結(jié)石(DENT’S 病)，X-連鎖隱性腎結(jié)石(X-linked recessive nephrolithiasis，XRN)，X-連鎖隱性低磷性佝僂病(X-linked recessive hypophesphatemic nickets，XLRH)都在Xp11.22上表示，這個(gè)位置正是clcn5基因的特有位置。調(diào)查11個(gè)有CLCN5異常的血緣家族后，Lloyd SE等報(bào)道，在異型卵母細(xì)胞上野生型clcn5的異種表達(dá)能糾正外流的氯離子通道，但突變后則可以完全廢除或明顯減少，所以CLCN5可能參與了因腎小管功能異常而引起的腎結(jié)石形成。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞融合制備出抗CLCN5抗體后通過(guò)ELISA、Western blot 等方法對(duì)抗體進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)于今后對(duì)CLCN5 的繼續(xù)研究和因其突變引起的疾病的病因和治療方法等的研究提供了初步的幫助。
1 材料和方法
1.1材料
1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞人頜下腺細(xì)胞系HSG、小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0為本實(shí)驗(yàn)室保存，融合用的脾細(xì)胞及骨髓瘤細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室制備及培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用小鼠系BALB/c 小鼠為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供。
1.1.2主要試劑含抗CLCN5單克隆抗體的細(xì)胞上清均為本實(shí)驗(yàn)室制備。新生牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)，弗氏佐劑(美國(guó)Sigma 公司)，HRP-羊抗鼠IgG(廣州中杉生物有限公司)，96、24、6孔板與10 ml和50 ml的滅菌沉淀管或瓶(BECTON DICKNSON公司)，ECL顯色試劑盒(Amersham公司)，PVDF膜、醫(yī)用X-膠片、濾紙(KODARK公司)。其他試劑均為本實(shí)驗(yàn)室參照《分子克隆》第三版自配。
1.1.3儀器37℃恒溫水浴箱(北京精科華瑞儀器有限公司)，酒精燈、離心機(jī)(瑞江分析儀器有限公司)，酶聯(lián)檢測(cè)儀(BIO-RAD公司)，洗板機(jī)(北京拓普分析儀器有限公司)，酶標(biāo)板、系列移液器(Eppendorf 公司)，恒壓或恒流電源、垂直板電泳槽和制膠模具、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD公司)。
1.2 mAb制備方法
1.2.1免疫動(dòng)物初次免疫用純化的CLCN5/GST融合蛋白，用生理鹽水稀釋后與等體積弗氏完全佐劑混勻攪拌乳化后，BALB/c小鼠皮下免疫兩點(diǎn)，其余腹腔注射。4周后用同樣劑量的抗原與不完全佐劑混勻進(jìn)行二次免疫，方法同首次免疫，7 d后ELISA測(cè)血清效價(jià)決定是否三免，于融合前3天再用同等劑量的抗原腹腔注射，加強(qiáng)免疫1次。
1.2.2雜交瘤細(xì)胞株的建立細(xì)胞融合、篩選及克隆化。取加強(qiáng)免疫后小鼠，眼眶采血后處死，酒精消毒后平皿中取脾，轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中，加RPMI 1640至30 ml稀釋后取1×108 個(gè)細(xì)胞備用。取SP2/0細(xì)胞1×107個(gè)與之前的脾細(xì)胞混合離心，1 500~2 000 r/min離心5 min，棄上清，將沉淀彈成糊狀，37℃水浴，1 min內(nèi)加入1 ml PEG并攪拌，37℃水浴放置1 min。分別在1、2、3 min內(nèi)加入1、4、15 ml RPMI 1640終止融合，800 r/min離心7 min。棄上清彈勻細(xì)胞，加入HAT培養(yǎng)液，混勻后，滴入96孔板，放入CO2培養(yǎng)箱中，并定時(shí)換液，同時(shí)用CLCN5/GST融合蛋白和GST蛋白做包被抗原，采用間接ELISA篩選細(xì)胞培養(yǎng)上清，陽(yáng)性克隆以有限稀釋法克隆化。
1.3 抗 CLCN5 mAb的特性鑒定
1.3.1抗CLCN5抗血清效價(jià)測(cè)定應(yīng)用ELISA的方法對(duì)免疫后的融合鼠血清進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。
1.3.2 ELISA篩選采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定抗體效價(jià)。首先用純化的抗原蛋白包被96孔酶聯(lián)板，4℃過(guò)液或37℃ 2 h，洗液洗滌3次，加封閉液4℃過(guò)液或37℃2 h后洗3次，拍干，4℃保存。將融合細(xì)胞上清加樣到包被好的酶標(biāo)板上，每板取無(wú)細(xì)胞生長(zhǎng)的2孔為陰性對(duì)照，再選無(wú)細(xì)胞生長(zhǎng)的2孔加陽(yáng)性血清，作為陽(yáng)性對(duì)照，37℃孵育30 min洗板4次，拍干，加入1∶5 000稀釋的酶標(biāo)二抗37℃孵育30 min，洗板4次，拍干。37℃ DAB顯色15~30 min，加終止液，450 nm測(cè)定OD值。
1.3.3Western blot鑒定mAb 的特異性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：將樣品與樣品緩沖液按3∶1的比例混勻，100℃水浴加熱3～5 min。按《分子克隆》制備分離膠和濃縮膠溶液，待濃縮膠溶液聚合后小心拔出樣品梳，將樣品孔中依次加入Marker、HSG胞漿蛋白、CLCN5蛋白和含GST標(biāo)簽蛋白各8、3、10 、10 μl。在恒壓80 V條件下開(kāi)始電泳，至樣品溶液進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)至180 V，直至電泳結(jié)束。免疫印跡法檢測(cè)抗體的反應(yīng)性和特異性：取出凝膠，切去凝膠邊緣，浸于TF緩沖液30 min。另取與凝膠同樣大小的厚濾紙2張，硝酸纖維素膜(PVDF膜)1張，用TF緩沖液浸透。用半干膠轉(zhuǎn)移儀進(jìn)行轉(zhuǎn)移。在電極板上依次放上濕厚濾紙1張，硝酸纖維素膜1張，電泳凝膠，濕濾紙3張，蓋上電極板，按0.8 mA/cm2硝酸纖維素膜，恒電壓18 V轉(zhuǎn)移30 min。取出硝酸纖維素膜浸入封閉液37℃封閉60 min，棄去液體。加入6 ml適量的供試品抗體溶液，4℃反應(yīng)過(guò)夜。硝酸纖維素膜用TBST 緩沖液洗1次，再用TBST 緩沖液浸洗3次，每次8 min。棄去液體，再加入10 ml適量的HRP或AP標(biāo)記的二抗，37℃搖動(dòng)反應(yīng)40 min。硝酸纖維素膜用TBST緩沖液洗1次，再用TTBS 緩沖液浸洗4次，每次8 min。棄去液體，加入混合好的ECL顯色液 (1 ml/張膜)，在暗室進(jìn)行曝光顯影。陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)呈現(xiàn)明顯曝光帶，陰性結(jié)果沒(méi)有曝光帶。
2結(jié)果
2.1血清效價(jià)測(cè)定情況
CLCN5抗原免疫BALB/c小鼠抗體血清效價(jià)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。
圖1CLCN5抗原免疫BALB/c小鼠抗體血清效價(jià)測(cè)定
1/8 192 000為陰性對(duì)照
2.2 雜交瘤細(xì)胞株的建立
以CLCN5為免疫原、經(jīng)免疫動(dòng)物、細(xì)胞融合及克隆化建立了4株能穩(wěn)定分泌抗人CLCN5單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。細(xì)胞株分別命名為：AF111、BAE094、BAE102、BBE065，經(jīng)ELISA檢測(cè)此4株細(xì)胞上清均為陽(yáng)性，見(jiàn)表1。
2.3單克隆抗體的鑒定
圖2為HSG蛋白的SDS�PAGE。由圖3可知Western blot的結(jié)果，4株抗體中只有BAE102細(xì)胞株分泌的抗體在預(yù)期的位置83 kDa附近有一條特異性條帶，GST-CLCN5 融合蛋白在32 kDa處有一陽(yáng)性條帶。
3討論
實(shí)驗(yàn)中前兩次Western blot均失敗，第一次顯影無(wú)特異性條帶，且染膜后Marker無(wú)條帶顯示，初步懷疑轉(zhuǎn)膜失敗、Marker上樣量不足導(dǎo)致，第二次背景過(guò)深且條帶不清可能是由于二抗?jié)舛冗^(guò)高導(dǎo)致，故第三次增加了Marker上樣量并將二抗以1∶7 500的比例稀釋實(shí)驗(yàn)成功，Western blot所有加入純抗原蛋白的孔都無(wú)特異性條帶出現(xiàn)，其SDS-PAGE 也沒(méi)有任何蛋白條帶，所以初步懷疑抗原濃度不足或此抗原無(wú)效。
氯離子通道在細(xì)胞興奮性調(diào)節(jié)，跨上皮物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞容積調(diào)節(jié)和細(xì)胞器酸化作用等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1,2]。這種功能的多樣性對(duì)應(yīng)于由不同基因編碼的不同種類的氯離子通道。目前在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中已經(jīng)克隆得到了9種不同的CLC通道[3]。而且,在植物、酵母和細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)了這種通道蛋白。有些CLC通道的功能缺失或改變與人類的某些遺傳性疾病有密切的關(guān)系，如先天性肌強(qiáng)直、腎結(jié)石和bartter’s綜合征。1974年Buckalew VW 報(bào)道一家族4代成員中均有以蛋白尿、高鈣尿腎結(jié)石或腎鈣質(zhì)沉積、腎小管酸中毒為表現(xiàn)的遺傳性綜合征，當(dāng)時(shí)該病被認(rèn)為是遺傳性腎小管酸中毒。但隨著基因定位技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)患者都存在X染色體短臂上clcn5基因的突變，由于該基因編碼了腎小管上的一種電壓控制的氯離子通道CLCN5，突變引起組成CLCN5蛋白的氨基酸丟失，通道功能喪失，因此這類疾病被稱為X-連鎖綜合征，臨床可分為4種類型，即X-連鎖隱性腎結(jié)石(X-linked recessive nephrolithiasis，XRN)、DENT’S病(DENT’S disease)、X-連鎖隱性低磷性佝僂病(X-linked recessive hypophesphatemic nickets，XLRH)、日本兒童特發(fā)性低分子量蛋白尿[4~8]。對(duì)本抗原的進(jìn)一步研究及對(duì)其相應(yīng)抗體的鑒定有助于腎結(jié)石病因的探索和尋找適合的治療方法。而制備CLCN5抗體的研究在未來(lái)可分別應(yīng)用于以下兩個(gè)方面[9，10]：①研究與CLCN5分子相互作用的分子;②Western blot分析、篩選表達(dá)CLCN5分子的細(xì)胞和組織。本試驗(yàn)制備的鼠抗CLCN5抗血清為進(jìn)一步研究該分子的生物學(xué)功能及其在其他組織中的作用提供了必要的工具，對(duì)CLCN5的初步研究與相應(yīng)抗體的制備及鑒定不僅對(duì)與其他CLC通道蛋白的研究及其抗體制備奠定了基礎(chǔ)，并對(duì)腎結(jié)石和X-連鎖綜合征的臨床診斷和治療提供了重要的制劑。
我們免疫小鼠并通過(guò)細(xì)胞融合制備了抗CLCN5的細(xì)胞上清，并通過(guò)ELISA、Western blot 等方法進(jìn)行了其特異性分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞上清中產(chǎn)生了抗CLCN5抗體，在4株抗體中只有BAE102抗體對(duì)CLCN5蛋白的ELISA呈陽(yáng)性，對(duì)GST融合蛋白的Western blot呈陽(yáng)性，說(shuō)明這些抗體可特異性識(shí)別重組表達(dá)及細(xì)胞中表達(dá)的CLCN5，并可特異性識(shí)別天然狀態(tài)下的CLCN5，其對(duì)CLCN5具有很好識(shí)別特性。
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