關(guān)于pcr技術(shù)論文

　　PCR技術(shù)是一種體外酶促合成、擴(kuò)增特定DNA片段的方法。下面是學(xué)習(xí)啦小編整理的關(guān)于pcr技術(shù)論文，希望你能從中得到感悟!

　　關(guān)于pcr技術(shù)論文篇一

　　技術(shù)的研究進(jìn)展

　　摘要 PCR技術(shù)是一種體外酶促合成、擴(kuò)增特定DNA片段的方法。因其高強(qiáng)的特異性和靈敏度以及檢測(cè)速度快、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛地應(yīng)用于水產(chǎn)、微生物檢測(cè)等許多領(lǐng)域。該文從PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用方面進(jìn)行了綜述，并對(duì)其發(fā)展做出了展望。

　　關(guān)鍵詞 PCR技術(shù);研究進(jìn)展;應(yīng)用

　　中圖分類號(hào) Q819 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739(2012)10-0047-02

　　PCR(polymerase chain reaction，PCR)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，它是一種體外酶促合成，擴(kuò)增特定DNA片段的方法。1985年，美國(guó)Karray等學(xué)者首創(chuàng)了PCR技術(shù)，并由美國(guó)Cetus公司開(kāi)發(fā)研制[1]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和突破，PCR技術(shù)已在多個(gè)領(lǐng)域得到廣泛地應(yīng)用，如微生物檢測(cè)、獸醫(yī)學(xué)、水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面。由于該技術(shù)具有較強(qiáng)的靈敏度、準(zhǔn)確度和特異性，又能快速進(jìn)行檢測(cè)，因而其應(yīng)用領(lǐng)域也在不斷延伸[2-3]。隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展，在常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上又衍生出了許多技術(shù)，如多重PCR(mutiplex PCR)技術(shù)[4]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)技術(shù)[5]、單分子PCR技術(shù)[6]。

　　1 PCR技術(shù)原理

　　PCR技術(shù)是根據(jù)待擴(kuò)增的已知DNA片段序列、人工合成與該DNA 2條鏈末端互補(bǔ)的2段寡核苷酸引物，在體外將待檢DNA序列(模板)在酶促作用下進(jìn)行擴(kuò)增。PCR的整個(gè)技術(shù)過(guò)程經(jīng)若干個(gè)循環(huán)組成，一個(gè)循環(huán)包括連續(xù)的3個(gè)步驟：第1步是高溫條件下的DNA模板變性，即模板DNA在93~94 ℃的條件下變性解鏈;第2步是退火，即人工合成的2個(gè)寡核苷酸引物與模板DNA鏈3’端經(jīng)降溫至55 ℃退火;第3步是延伸，即在4種dNTP底物同時(shí)存在的情況下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物鏈將沿著5’-3’方向延伸與模板互補(bǔ)的新鏈[7]。經(jīng)過(guò)這個(gè)循環(huán)后，合成了新鏈，可將其作為DNA模板繼續(xù)反應(yīng)，由此循環(huán)進(jìn)行。循環(huán)進(jìn)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的量以指數(shù)級(jí)方式增加，一般單一拷貝的基因循環(huán)25~30次，DNA可擴(kuò)增l00萬(wàn)~200萬(wàn)倍[1]。PCR反應(yīng)的步驟很簡(jiǎn)單，但是具體的操作是復(fù)雜的，如退火溫度的確定、延伸時(shí)間的長(zhǎng)短以及循環(huán)數(shù)等。因此，不同的反應(yīng)體系應(yīng)該確定適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件，以避免假陰性或假陽(yáng)性等情況的產(chǎn)生。

　　2 PCR技術(shù)的分類

　　在傳統(tǒng)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，根據(jù)人們的需要以及各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用要求，又衍生出很多種類的PCR技術(shù)。新技術(shù)在各領(lǐng)域廣泛應(yīng)用并逐漸改進(jìn)，為進(jìn)一步的研究提供了基礎(chǔ)。

　　2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

　　1996年，學(xué)者經(jīng)過(guò)研究，在傳統(tǒng)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，首創(chuàng)了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，新技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用至醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、分子生物學(xué)和其他基礎(chǔ)研究領(lǐng)域。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)基于傳統(tǒng)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，還具有實(shí)時(shí)性、準(zhǔn)確性、無(wú)污染，實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化操作和多重反應(yīng)，是PCR技術(shù)研究史上從定性到定量的飛躍[8]。

　　熒光定量PCR技術(shù)最大的特點(diǎn)是能將熒光基團(tuán)加入到PCR反應(yīng)體系中，借助于熒光信號(hào)，累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析[9]。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)這一特點(diǎn)是常規(guī)PCR技術(shù)所不具有的，因?yàn)槠鋵?duì)擴(kuò)增反應(yīng)不能進(jìn)行隨時(shí)的檢測(cè)。常規(guī)PCR技術(shù)的擴(kuò)增終產(chǎn)物需要在凝膠電泳等條件下才能進(jìn)行，無(wú)法對(duì)起始模板進(jìn)行準(zhǔn)確的定量，而熒光定量PCR技術(shù)的反應(yīng)進(jìn)程可以根據(jù)熒光信號(hào)的變化做出準(zhǔn)確的判斷[10-11]。一個(gè)PCR循環(huán)反應(yīng)結(jié)束之后，定量PCR儀可以收集1個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，熒光信號(hào)強(qiáng)度的變化可以反映產(chǎn)物量的變化情況，這樣就可以得到1條熒光擴(kuò)增曲線[12]。熒光信號(hào)在指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物熒光信號(hào)的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性對(duì)應(yīng)關(guān)系，然后進(jìn)行定量分析[13]。

　　2.2 多重PCR技術(shù)

　　多重PCR(mutiplex PCR)技術(shù)是PCR技術(shù)的一種，為同一管中加入多對(duì)特異性引物，與PCR管內(nèi)的多個(gè)模板反應(yīng)，在一個(gè)PCR管中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)DNA分子。多重PCR技術(shù)可以擴(kuò)增一個(gè)物種的一個(gè)片段，也可以同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)物種的不同片段[14]。

　　在同一反應(yīng)體系中，多重PCR技術(shù)進(jìn)行多個(gè)位點(diǎn)的特異性擴(kuò)增時(shí)，引物間的配對(duì)、引物間的競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增等會(huì)對(duì)擴(kuò)增效果產(chǎn)生重要影響。一方面，如果能選擇適宜的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，可極大地提高多重PCR的擴(kuò)增效果[15]。主要包括退火溫度、退火及延伸時(shí)間、PCR緩沖液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等。另一方面，DNA的抽提質(zhì)量也影響多重PCR擴(kuò)增效率，如DNA抽提不干凈或降解都將影響PCR擴(kuò)增效果[16]。

　　2.3 單分子PCR技術(shù)(SM-PCR)

　　單分子PCR技術(shù)是在傳統(tǒng)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展的，基本循環(huán)過(guò)程相同，但在反應(yīng)條件、模板數(shù)量、DNA 聚合酶選擇、引物設(shè)計(jì)方面具有不同點(diǎn)。該技術(shù)是以少量或單個(gè)DNA分子為模板進(jìn)行的PCR[17]。

　　單分子PCR技術(shù)反應(yīng)中，DNA 模板濃度極低，這就要求模板有較高的質(zhì)量。因?yàn)檫@是試驗(yàn)成敗的決定性因素。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，應(yīng)該嚴(yán)格控制GC的含量和Tm值，同時(shí)盡量避免引物間存在可配對(duì)序列。在反應(yīng)混合物模板數(shù)極低的情況下，若引物之間存在少量配對(duì)序列，擴(kuò)增時(shí)極易形成二聚體，使反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行，得不到所需要的產(chǎn)物[18]。由于單分子PCR技術(shù)反應(yīng)的變性溫度(96~98 ℃)大多比常規(guī)PCR技術(shù)(94 ℃)略高，因而對(duì)DNA 聚合酶熱穩(wěn)定性的要求也更加嚴(yán)格，需要有較好的熱穩(wěn)定性，以防止溫度過(guò)高而使其失活。其變性時(shí)間(5~15 s)、退火時(shí)間及延伸時(shí)間也短于常規(guī)PCR技術(shù)[17]。

　　3 PCR技術(shù)的應(yīng)用

　　3.1 PCR技術(shù)在水產(chǎn)上的應(yīng)用

　　基因表達(dá)是檢測(cè)某個(gè)基因在不同發(fā)育期或不同組織中的表達(dá)量變化，或受到某種試驗(yàn)處理過(guò)程中的影響而出現(xiàn)表達(dá)量變化的情況。有學(xué)者應(yīng)用real-time PCR技術(shù)研究碳水化合物含量對(duì)翹嘴紅鲴糖代謝酶G6Pase、GK以及PEPCK表達(dá)量的影響[19-21]，研究結(jié)果可為翹嘴紅鲴飼料配方中的最合適糖含量提供理論依據(jù)。孫淑娜等[22]研究葉酸拮抗劑對(duì)斑馬魚(yú)心臟發(fā)育相關(guān)基因BMP2b及HAS2表達(dá)的影響，表明葉酸拮抗劑對(duì)早期胚胎的心臟發(fā)育影響較大，可導(dǎo)致斑馬魚(yú)心臟發(fā)育延遲及心臟形態(tài)異常，并下調(diào)斑馬魚(yú)心臟發(fā)育相關(guān)基因BMP2b及HAS2的表達(dá)，這可能是葉酸生物學(xué)活性受抑后導(dǎo)致心臟發(fā)育異常的機(jī)制之一。Sawyer et al[23]以斑馬魚(yú)的未受精卵、胚胎、仔魚(yú)和成魚(yú)為研究材料，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)了P450aromA和P450aromB在不同組織的表達(dá)量，表明在各組織中均有2種基因的表達(dá)，但表達(dá)量顯著不同，呈現(xiàn)組織特異性。

　　3.2 PCR技術(shù)在微生物檢測(cè)上的應(yīng)用

　　1990年，Bej et al[24]在利用多重PCR的方法檢測(cè)了Leg-ionella類菌種和大腸類細(xì)菌，其結(jié)果是通過(guò)點(diǎn)對(duì)點(diǎn)方法固定的多聚dT尾捕捉探針和生物素標(biāo)記的擴(kuò)增DNA進(jìn)行雜交來(lái)檢測(cè)的。張志東等檢測(cè)口蹄疫病毒(FMDV)持續(xù)性感染的帶毒動(dòng)物，表明實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有快速檢測(cè)、準(zhǔn)確、客觀等優(yōu)勢(shì)，較優(yōu)于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法[25-26]。Metzger-Boddien et al[27]對(duì)PCR-ELISA的方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，樣品中沙門氏菌的檢出率可以達(dá)到98%。

　　4 展望

　　傳統(tǒng)PCR技術(shù)以及衍生出來(lái)的新型PCR技術(shù)自面世以來(lái)，已被廣泛應(yīng)用到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。隨著技術(shù)方法的不斷改進(jìn)與完善，熒光定量PCR技術(shù)將會(huì)逐漸完善并廣泛應(yīng)用。多重PCR技術(shù)在食品病原微生物、非致病微生物及環(huán)境微生物檢測(cè)中具有重要作用;未來(lái)的研究主要集中在去除食品抑制因子干擾、改進(jìn)樣品前處理技術(shù)等方面，其次是整合應(yīng)用多重PCR與其他技術(shù)，必將在未來(lái)食品微生物檢測(cè)中有非常好的應(yīng)用前景。

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