克隆技術(shù)論文(2)
克隆技術(shù)論文篇二
差異表達(dá)基因克隆技術(shù)的新進(jìn)展
提要 分離并克隆差異表達(dá)基因是 目前 功能性基因 研究 的熱點(diǎn)。mRNA差異展示是篩選差異表達(dá)基因最有效的技術(shù)之一，它的主要不足是有一定假陽性。RDA、SSH、DSD、LSH技術(shù)能夠克服假陽性，但也具有一定的不足，應(yīng)根據(jù)需要選擇運(yùn)用。隨著能擴(kuò)增長(zhǎng)片段及具有自動(dòng)校正功能的Taq酶出現(xiàn)及 應(yīng)用 ，這些技術(shù)將會(huì)不斷完善與 發(fā)展 ，具有廣闊的應(yīng)用前景。
關(guān)鍵詞 差異表達(dá)基因;克隆
現(xiàn)代 分子生物學(xué)研究表明，人類基因組約由10萬左右的不同基因組成，這些基因選擇性的表達(dá)決定了機(jī)體整個(gè)生命過程，基因表達(dá)的變化處于控制生物學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制的中心位置。因此，分離并克隆差異表達(dá)基因不僅有助于闡明生命的粵秘，而且還能為基因診斷與 治療 提供重要的 理論 依據(jù)。近幾年來，差異表達(dá)基因克隆技術(shù)不斷完善與發(fā)展，已成為研究腫瘤和疾病等相關(guān)基因的重要手段。
一、mRNA差異展示
mRNA差異展示(mRNA differential display,DDRT-PCR)是目前篩選差異表達(dá)基因最有效的 方法 之一，其基本原理是：3´端采用錨定引物，與mRNA3´poly a結(jié)合，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，形成mRNA：cDNA雜交分子，5´端采用20條隨機(jī)引物，與錨定引物一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序膠顯示出來，再回收鑒定克隆差異條帶。1992年Liang和Pardee[1]建立此技術(shù)時(shí)，5´端采用20條隨機(jī)引物，每條由10個(gè)堿基組成，3´端采用12條引物即T12MN(M=A、C或G，N=A、G、C、T)。這種組合從統(tǒng)計(jì)學(xué)上幾乎能完全覆蓋所有的mRNA序列，差異表達(dá)的基因會(huì)全部呈現(xiàn)出來。實(shí)踐證明，這種方法有效，但假陽性率在50%～70%左右，差異條帶在Northern印跡上重現(xiàn)性差，后續(xù)處理也比較復(fù)雜。1994年Ito[2]等對(duì)3´端引物進(jìn)行了改進(jìn)，把12條引物改為3條，即T12A、T12C、T12G，使得實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)化。1995年Ayala[3]等提出了在3´端錨定引物與5´端隨機(jī)引物上皆增加10個(gè)堿基，使得上下游引物Tm值在60℃左右，PCR循環(huán)參數(shù)也改為前5個(gè)循環(huán)采用Liang和Pardee推薦的參數(shù)，即94℃30s，40℃2min,72℃30s。經(jīng)這樣改進(jìn)，顯著地增強(qiáng)了差異條帶的重復(fù)性和敏感性，同時(shí)使得差異條逼帶的克隆十分方便。1996年4月，Liang和Pardee[4]對(duì)5´端此物進(jìn)行了改進(jìn)，引物條數(shù)改為8條，皆帶上HindⅢ酶切位點(diǎn)，每條由13個(gè)堿基組成，3´端錨定引物采用3條，也帶上HindⅢ酶切位點(diǎn)，每條由18個(gè)堿基組成，PCR循環(huán)條件仍采用94℃30s,40℃2min,72℃30s,40個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸7min。1998年[5]我們?cè)贚iang和Pardee改進(jìn)的基礎(chǔ)上，對(duì)PCR循環(huán)參數(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，即前5個(gè)循環(huán)采用94℃30s,40℃2min,72℃30s,后35個(gè)循環(huán)采用94℃30s,55℃2min,72℃30s，最后在72℃延伸7min。經(jīng)這樣改進(jìn)，既保持了擴(kuò)增效率，又增強(qiáng)了差異條帶的特異性及重復(fù)性，降低了假陽性率。
總之，mRNA差異展示具有簡(jiǎn)便、快速、所需起始材料少、同時(shí)可在多個(gè)材料之間或不同處理材料之間進(jìn)行比較等優(yōu)點(diǎn)，但具有較高頻率的假陽性和短小的差異片段的缺點(diǎn)，給后續(xù)處理帶來一系列 問題 ，雖然此技術(shù)經(jīng)過了一些起改進(jìn)，但這兩個(gè)缺點(diǎn)仍限制著此方法的充分應(yīng)用。
二、代表性差示 分析
代表性差示分析(representational difference analysis,RDA)最早由Lisitsyn等提出的。1994年，Hubank和Schatz[6]將其應(yīng)用于克隆差異表達(dá)基因，其基本原理是：靶方(Tester,T)和驅(qū)動(dòng)方(Driver,D)的cDNA在進(jìn)行差方式分析前均用一種識(shí)別4堿基序列的限制酶作切割處理，形成平均長(zhǎng)度為256bp的cDNA片段代表群，第一次T與D雜交反應(yīng)時(shí)，兩者總量比為1：100，第二次增加到1：400，第三次增加到1：8000，再利用PCR以指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈模板，而僅以線性形式擴(kuò)增單鏈模板這一特性，通過降低cDNA群體復(fù)雜度和多次更換cDNA兩端接頭，來特異擴(kuò)增目的基因片段。特別是T減D雜交反應(yīng)后僅設(shè)置了72℃ 復(fù)性與延伸及95℃變性這兩個(gè)循環(huán)參數(shù)，共20個(gè)循環(huán)，從而使PCR產(chǎn)物特異性大大提高。此技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)是差異條帶在Northern印跡上重現(xiàn)性好，假陽性少。缺點(diǎn)是所需起始材料較多，更多信賴于PCR技術(shù)，T與D之間若存在較多差異，或T中存在某些基因上調(diào)表達(dá)，則難達(dá)到預(yù)期目的，而且工作量比DDRT-PCR大，周期長(zhǎng)。
三、抑制性扣除雜交
抑制性扣除雜交(suppression subtractive hybridization,SSH)，是1996年Diatchenk[7]等提出的一種新的克隆基因技術(shù)，其基本原理是：先將T與D方cDNA用限制酶切割為小片段，將T方平均分為兩份，分別連接不同的接頭，然后與過量的D方cDNA進(jìn)行不充分雜交。根據(jù)復(fù)性動(dòng)力學(xué)原理，濃度高的單鏈分子迅速?gòu)?fù)發(fā)，而濃度低的單鏈分子仍以單鏈形式存在。然后混合兩份雜交樣品，同時(shí)加入新的變性D方cDNA進(jìn)行第二次扣除雜交，雜交完全后補(bǔ)平末端，加入合適引物接頭(接頭1與接頭2引物)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。當(dāng)DNA兩條鏈含相同接頭時(shí)，其PCR擴(kuò)增受到抑制，而含不同接頭的雙鏈DNA分子才可進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，其產(chǎn)物即為目的片段。
此技術(shù)避免了消減雜交過程中分離單雙鏈DNA的步驟，可成千倍地?cái)U(kuò)增目的片段，能分離出T方上調(diào)表達(dá)的基因，與DDRT-PCR相比，具有假陽性少重復(fù)性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，它的最大不足就是需要較多的起始材料，更多依賴于PCR技術(shù)，不能同時(shí)進(jìn)行數(shù)個(gè)材料之間或不同處理材料之間的比較。
四、差異消減展示
差異消減展示(differential subtraction display,DSD)是1998年Jose等[8]提出的，它是在DDTR-PCR呈現(xiàn)出差異條帶之后，同時(shí)回收差異條帶與對(duì)照方的相應(yīng)范圍的條帶，靶方回收的差異條帶用非生物素標(biāo)記的引物與dNTPs進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而對(duì)照方回收的差異條帶用含生物素標(biāo)記的dATP的dNTPs進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物進(jìn)行消減雜交，用鏈親和素去除共有的產(chǎn)物，剩下的產(chǎn)物由帶有α-32P dATP的dNTPs進(jìn)行擴(kuò)增，再重復(fù)差異展示，回收差異條帶并克隆。此技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)是獲得差異條帶在Northern印跡上重現(xiàn)性好，假陽性少，敏感性強(qiáng)，可獲得長(zhǎng)片段，起始材料要求少，可獲取低豐度差異表達(dá)基因，缺點(diǎn)是步驟繁瑣，工作量大，周期性長(zhǎng)，更多依賴于PCR技術(shù)。
另外，趙忠良博士把長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增(LPCR)與消并減雜交技術(shù)結(jié)合起來，建立了LPS技術(shù)，并運(yùn)用此技術(shù)從抗原呈細(xì)胞中獲取了170多個(gè)差異表達(dá)基因。此技術(shù)的基因原理是：T與D方分離出cDNA后，運(yùn)用5´端帽子引物與3´端錨定引物，對(duì)cDNA進(jìn)行大量擴(kuò)增，其產(chǎn)物直接進(jìn)行消減雜交，然后過柱子，去除相同的基因，剩余的部分再與D方cDNA進(jìn)行二輪消減雜交，再過柱子，去除非差異部分，剩下的差異部分進(jìn)行第三輪消減雜交，其產(chǎn)物進(jìn)行分級(jí)分段克隆。這種 方法 最大的好處是：起始材料需要少，可獲得差異基因，假陽性少，有可能獲得全長(zhǎng)差異表達(dá)基因。
總之，隨著高效擴(kuò)增的Taq酶與具有自動(dòng)校正功能的Taq酶的出現(xiàn)，長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增技術(shù)的優(yōu)化，差異表達(dá)基因克隆技術(shù)將會(huì)不斷 發(fā)展 ，但 目前 主要有以上幾種方法，各有其優(yōu)缺點(diǎn)， 研究 者應(yīng)根據(jù)自己的實(shí)際情況，選擇合適的技術(shù)方法，以其達(dá)到自己預(yù)期的目的。
參考 文獻(xiàn)
1 Liang P et al.Science,1992:257(14):967
2 Ito T et al.FEBS letters,1994;351:231
3 Ayala M et al.Biotechniques,1995;18(5):842
4 GenHunter Corporation,RNA imageTM,kit(cat NO.G501) for mRNA diflerential& nbsp;display,1996,April,12
5 Cui DX et al.Journal of the Fourth Military university,1998;18(6):601
6 Hubank M et al.NuclEic Acids Res,1994;22:5640
7 Diatchenko L et al.Proc Natl Sci USA,1996;93:6025
8 Jose RP et al.Analytical Biochemistry,1998;257:161
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