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　　基因的科技論文范文2500字篇一

　　[生物]基因槍法轉化水稻的研究進展

　　摘要：　水稻(Oryza sativa)是世界上最主要的糧食作物之一。近年來，DNA重組技術、遺傳操作技術、水稻基因圖譜的研究取得了顯著 發(fā)展，美國Monsanto 公司2000年4月、Syngenta公司2001年2月先后宣告完成粳稻日本晴(Nipponbare)基因組測序草圖。我國也已宣布完成秈稻9311的序列框架圖。目前以大規(guī)模分離、鑒定基因組序列功能為特征的水稻功能基因組研究正在迅速發(fā)展，而這一研究之后必然是依托于高效的水稻遺傳轉化體系，因此水稻遺傳轉化研究越來越成為人們關注的焦點。

　　水稻遺傳轉化體系已比較完善，農桿菌介導法、基因槍法、PEG法、花粉管通道法等方法均在水稻遺傳轉化中 應用并獲得轉基因植株，但目前用的最多的方法是基因槍法和農桿菌介導法。禾谷類作物由于不是農桿菌的天然宿主，曾一度限制了農桿菌介導法轉化水稻。基因槍法由于其沒有宿主限制，對單子葉和雙子葉植物都能進行有效地轉化，因而得到了很大的發(fā)展。本文就基因槍法的基本原理及其優(yōu)缺點、影響基因槍法轉化水稻的幾個關鍵因素、外源基因的遺傳特性及存在的問題等方面作簡要綜述。

　　1 基因槍法的原理及優(yōu)缺點

　　1.1 基因槍法的原理

　　基因槍法(paricle gun)又稱微彈轟擊法(micro- projecticle bombardment，Particle bombardment，or biolistics)。其基本原理是將外源DNA包被在微小的金?；蜴u粒表面，然后在高壓的作用下，微粒被高速射入受體細胞或 組織，微粒上的外源DNA進入細胞后，整合到植物染色體上，得到表達，從而實現基因的轉化。

　　1.2 基因槍法的優(yōu)、缺點

　　1.2.1 基因槍法的優(yōu)點

　　(1)無宿主限制。基因槍法本質上是一種物理過程，沒有宿主限制，對單子葉和雙子葉植物都能進行有效地轉化。以原生質體為受體的PEG轉化法、電擊法、脂質介導轉化法和顯微注射法等雖然可以用于單子葉植物的轉化，然而，以原生質體作為受體材料要求受體系統(tǒng)具有良好的再生性能，這對于大多數禾谷類作物來說是較困難的，而且其再生的周期比較長，再生過程容易產生變異。

　　(2)靶受體類型廣泛，不受組織類型限制，幾乎所有具有潛在分生能力的組織或細胞都可以用基因槍進行轟擊轉化。目前用于基因槍轉化的受體材料十分廣泛，其中包括原生質體、懸浮細胞、根或莖的切段、葉圓片、成熟胚、幼胚、分生組織、愈傷組織、胚芽鞘等幾乎所有具有潛在分化能力的組織或細胞。

　　(3)可控度高，采用高壓放電或高壓氣體驅動的基因槍，可根據實驗需要，將載有外源DNA的金屬顆粒射入特定層次的細胞(如再生區(qū)的細胞)，使轉化細胞能再生植株，從而提高轉化頻率。

　　(4)操作簡便、快速。農桿菌介導法需要進行農桿菌感受態(tài)細胞的制備、共培養(yǎng)、抑菌等操作步驟，PEG轉化法、電擊法等需要進行原生質體分離與培養(yǎng)的繁瑣 工作，而基因槍法是一種物理過程，只要在無菌的條件下將載有外源基因的金屬顆粒轟擊受體材料，就可以進行篩選培養(yǎng)，因此它操作簡便、快速。

　　1.2.2 基因槍法的缺點

　　由于基因槍轟擊的隨機性，外源基因進入宿主基因組的整合位點相對不固定，拷貝數往往較多，這樣轉基因后代容易出現突變、外源基因容易丟失，容易引起基因沉默等現象的發(fā)生，不利于外源基因在宿主植物的穩(wěn)定表達。而且基因槍價格昂貴、運轉費用高。

　　2 影響基因槍法轉化水稻的幾個關鍵因素

　　2.1 水稻的基因型

　　栽培稻主要有秈稻和粳稻兩個亞種，其中秈稻品種是熱帶和亞熱帶地區(qū)的主要糧食作物，由于秈稻的組織培養(yǎng)特性及再生能力都與粳稻存在較大差別，在轉化過程中，秈稻的轉化效率顯著低于粳稻。李良材等用14個粳稻品種和23個秈稻品種進行了轉化實驗，其中所用的粳稻都得到轉基因植株，平均轉化率為10%左右，而秈稻只有14個得到轉基因植株，7個只得到轉基因愈傷組織，尚有2 個未產生反應，轉基因植株的轉化頻率只有2%～ 3%，明顯低于粳稻。

　　2.2 外植體類型

　　用于基因槍轉化的受體材料十分廣泛，幾乎所有具有潛在分裂分化能力的組織和細胞都可以作為受體材料，但要想獲得理想的轉化結果，根據水稻品種的不同，選擇適當的轉化受體材料是十分關鍵的。目前最常用的水稻基因槍轉化受體材料包括成熟胚、幼胚、花藥和幼穗。成熟胚的取材不受生長季節(jié)的限制.因而成為當前廣泛采用的受體材料。但對于某些水稻品種以成熟胚盾片愈傷組織為材料其誘導率很低，而且其愈傷組織繼代過程中往往出現褐化的情況，如培矮64S其愈傷組織的誘導率沒有超過50%。對于這樣的品種有必要采用以幼穗和幼胚為受體材料。

　　2.3 組織培養(yǎng)條件

　　組織培養(yǎng)條件影響水稻轉化效率，對水稻的愈傷組織培養(yǎng)一般用MB培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、N6 培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基，易自力等認為在培養(yǎng)基中添加2.5～5.0 mg/L的ABA可以有效地改善水稻愈傷組織的質量。鄭宏紅等在轉化前將受體材料轉移到含有一定濃度的甘露醇和山梨醇的高滲培養(yǎng)對受體材料進行處理，可明顯提高GUS基因的時表達效果，穩(wěn)定轉化的效果也有提高。田文忠等在誘導培養(yǎng)基或繼代培養(yǎng)基中加入細胞分裂素(玉米素)和萘乙酸，以及愈傷組織的部分干燥處理，這些措施明顯地提高秈稻愈傷組織的再生頻率。葉松青等在幼胚接種前低溫處理4 d或7 d 可提高愈傷組織的再生頻率，在分化培養(yǎng)基加入脯氨酸、DMSO(0.12%二甲基亞砜)能降低愈傷組織的褐化率。

　　2.4 基因槍的轟擊參數

　　基因槍的轟擊參數包括微彈的類型、微彈的速度、微彈的射程轟擊壓力、真空室的真空度、轟擊次數、DNA的純度與濃度、DNA沉淀劑等因素。

　　鎢粒子最先被用于基因槍轉化技術，是將煙草花葉病毒(TMV)RNA吸附到鎢粒子表面，轟擊洋蔥表皮細胞，經檢驗發(fā)現病毒RNA能夠進行復制。后來，McCabe(1988)又采用金粉為DNA微粒載體轉化大豆成熟利子，獲得了GUS基因的穩(wěn)定表達。金粉與鎢粉相比較，金粉可能比鎢粉對細胞的傷害與毒性更少，且顆粒大小一致。鎢粉比較便宜，但對某些細胞可能有毒害作用。

　　微彈運動速度是影響轉化率的一個重要因素，速度不同對受體組織和細胞的穿透力和傷害程度不同。秈稻和粳稻對微彈的速度要求不盡一致，轟擊時應根據轉化的受體材料特點做相應的調整。

　　微彈的射程是指樣品室的靶材料與基因槍擋板之間的距離，它是影響轉化率的一個重要因素。射程越大，穿透力越小;而射程越小，穿透力越大。刁現民等研究表明：以400 m/s以下的轟擊速度，10 cm樣品室高度的轉化結果顯著地低于7 cm 的結果。

　　轟擊壓力也是影響基因槍法轉化頻率的一個重要因素，易自力等在以6 cm的轟擊距離，每槍 100 μg金粉和0.2 μg的DNA用量的條件下，分別使用900 psi，1100 psi，1300 psi這3種不同的壓力膜對秈稻愈傷組織進行基因槍轉化，結果表明900 psi的壓力膜的轉化效果最好，每皿平均gus基因瞬時表達的藍點數最多。

　　轉化頻率與彈膛內的真空度呈正相關，但受體材料對真空度只有一定的耐受性，所以彈膛內的真空度有一定的限制。

　　轟擊的次數對轉化頻率有一定的影響，易自力等在以6 cm的轟擊距離，每槍100 μg金粉和 O.2 μg的DNA及900 psi壓力膜的情況下，對秈稻愈傷組織進行每皿轟擊1槍、2槍和3槍的比較研究。結果表明以轟擊2槍的效果最好。但薛銳等對16個水稻品種進行轟擊1次和2次的對比試驗，結果卻發(fā)現供試的16個品種均沒有發(fā)現明顯的差異。

　　DNA純度越高越容易獲得成功的轉化。這是因為高度純化的DNA射入受體細胞后整合到植物基因組的幾率更高。

　　DNA的濃度對基因轉化率也有影響，濃度太高容易使微彈粘連成大的凝結塊而使轉化頻率減低。目前對粳稻品種普遍采用的是金粉和質粒 DNA的濃度為每槍500 μg和1 μg，但對秈稻品種兩者的用量應該下降到1/4到1/8。

　　氯化鈣和亞精胺是常用的DNA沉淀劑，使 DNA附著在金屬顆粒的表面，沉淀劑的濃度對轉化頻率有影響。刁現民等在其它轟擊參數不變的情況下，分別進行了不同濃度的CaCl2和不同濃度的亞精胺對gus基因瞬時表達的影響，結果表明：0.5～1.5 mol/L的CaCl2，30～50 mmol/L的亞精胺的轉化率最高。

　　2.5 篩選劑類型

　　在植物基因轉化中，外源基因穩(wěn)定整合的頻率低。如何選擇適當的篩選標記以準確、有效地區(qū)分轉化與非轉化細胞，產生選擇壓力，使未轉化細胞不能生長，且不干擾細胞的正常生長與植株再生是轉化成功的重要環(huán)節(jié)之一。較早應用于水稻轉化實驗的選擇標記基因是新霉素磷酸轉移酶基因 (NPTⅡ)，對卡那霉素具有抗性。但由于水稻對卡那霉素具有天然抗性，沒能廣泛應用。G418是一種與卡那霉素餌近的氨基糖苷類抗生素，不能被新霉素磷酸轉眵酶激活，用它作選擇標記比卡那霉素更有效，而且再生綠苗頻率更高。現在bar當作選擇基因也已被用于水稻遺傳轉化研究。潮霉素磷酸轉移酶(HPTⅡ)基因是另一應用廣泛且更有效的標記基因，它具有對潮霉素的抗性，用潮霉素可以明顯區(qū)分已轉化和未轉化的組織。不同選擇劑應用濃度和選擇時間應根據不同材料的具體情況而定。馬炳田等報道了通過調節(jié)潮霉素的使用濃度，在抗蟲轉基因水稻研究中提高篩選率，結果表明：篩選時潮霉素使用濃度為20～30 mg/L;分化時潮霉素使用15～25 mg/L，可得到較高的抗性愈傷組織篩選率和綠苗分化率。

　　3 基因槍法轉化的外源基因的遺傳特性

　　基因槍法轉化是利用物理方法將裸露的DNA 隨機地導入植物受體細胞，其有序性和計量性都較差，整合機制乜不清楚。外源DNA的整合位點較多，可以在一條染色體或不同染色體上進行多位點整合。整合的外源DNA易發(fā)生結構變化和修飾，如丟失、環(huán)化甲基化等。整合外源DNA的拷貝數也較多，多拷貝的比例相對較高。整合外源DNA 的遺傳效應比較復雜，基因間的位置效應，共抑制現象等表現明顯。整合外源基因的遺傳特性多，轉基因植株的表型豐富，F1代植株的分離比例復雜，有的符合經典的孟德爾規(guī)律，但出現3∶1的分離比較少，其遺傳急定性也表現較差。唐祚舜等用基因槍法將潮霉素磷酸轉移酶基因導入粳稻品種 77170，獲得轉基因植株，自交后代(T1和T2)潮霉素抗性表現為顯性單基因位點的遺傳方式，符合孟德爾分離規(guī)律。陶利珍等用基因槍法將含有HPT 基因和GUS基因的質粒pILTAB227導入Basmati-1 等秈稻品種，對hpt基因在Basmati-1的各個世代的遺傳及表達分析表明：hpt基因普遍呈3∶1的分離，符合單基因控制的孟德爾遺傳規(guī)律。同時也發(fā)現了一些株系表現1∶1的分離，推測可能是由于基因沉默的結果。程在全等用質粒pTOK233和 pJPM44分別用農桿菌介導法和基因槍法轉化水稻愈傷組織，獲得一批轉基因植株，總DNA分別用質粒上的單切點酶酶切和雙切點酶切后Southern雜交分析轉基因拷貝數及轉基因表達盒數目，結果表明：農桿菌介導轉化法的轉基因植株的轉基因拷貝數相對少一些(平均為2.1和2.3)，而基因槍法轉化產生的轉基因植株的轉基因拷貝數相對多一些 (平均為4.2和5.6)，并且農桿菌介導轉化法的轉基因植株的基因表達盒DNA重排概率低于由基因槍法轉化產生的轉基因植株的基因表達盒DNA重排概率——農桿菌介導轉化法的DNA重排概率為 0.07和0.106;由基因槍法轉化的DNA重排概率為 0.57和0.66;華志華等通過對低拷貝數的轉基因植株京引119的世代連續(xù)跟蹤分析以及高世代材料的群體遺傳分析表明，共轉化基因bar和cecropin B 在基因組中緊密連鎖并能穩(wěn)定的遺傳和表達。

　　4 基因槍法的前景展望

　　用基因槍輔助農桿菌轉化可以提高轉化頻率。明小天等用攜帶普通雙元載體的根癌土壤桿菌 EHA105菌株對粳稻中花8號不敏感，轉化效率較低，低于5%。利用基因槍將根癌土壤桿菌細胞直接轟擊到水稻愈傷組織中可以顯著提高其轉化效率，轉化效率可達7%以上。趙燕等同樣發(fā)現，基因槍法與農桿菌介導法相結合的GUS基因瞬間表達藍點數比單獨用基因槍法和農桿菌介導法時分別提高了5.48%和12.07%。

　　基因槍可將外源基因導入細胞器，并且在酵母線粒體、煙草的葉綠體中取得了成功。細胞器的遺傳系統(tǒng)也具有重要作用，它與細胞核遺傳系統(tǒng)互相調節(jié)，共同調控著細胞的生命活動。利用基因槍技術為外源基因導入特定組織提供了可能，因此可以用于研究植物的發(fā)育及調控。如果把外源的特定基因導人不同的細胞或不同發(fā)育時期，則可以研究其基因表達的特點。通過培養(yǎng)條件的改變可以研究基因表達的環(huán)竟因素。

　　5 存在的問題及需進一步研究的問題

　　基因槍轉化技術從誕生以來已取得了可喜的進展，但還是存在不少問題有待進一步研究。如轉化頻率低，秈稻的轉化率一般不到1%，粳稻高一些。目前大多數只是報道轉化后的瞬時表達，而穩(wěn)定遺傳的比例甚少，外源基因的整合機制等理論問題也不太清楚。為此今后有待進一步研究的問題有：(1)應進一步提高基因槍的可控性、準確性、精確性;(2)微彈的表面結構、大小、均一性、承載 DNA的量及DNA微彈的制備技術;(3)不同物種，不同組織和細胞拘轟擊條件;(4)建立高頻率再生的基因轉化受體系統(tǒng)。盡管目前植物組織培養(yǎng)的研究已有近80年的歷史，但是建立一個高頻率的基因轉化受體系琉與一般的組織培養(yǎng)獲得再生植株還有很大的差距;(5)轟擊后進入受體細胞的 DNA生物學變化及其調控等理論問題。

　　注：

　　(1)參考文獻：略;需者可與本站Email 聯系，或到中國水稻研究所圖書館查閱;

　　(2)文章來源：云南 農業(yè)大學學報，2004年35卷第5期;

　　(3)作者單位：湖南 農業(yè)大學農學院。

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