藥學畢業(yè)論文開題報告(2)
藥學畢業(yè)論文開題報告
藥學畢業(yè)論文開題報告篇3
題 目 名 稱： 番瀉葉對小鼠尿量的影響
研究現(xiàn)狀：
一、普魯蘭酶
普魯蘭酶(Pullulanase，EC.3. 2. 1. 41)是一種能夠?qū)Ｒ恍郧虚_支鏈淀粉分支點中的α-1.6糖苷鍵，從而剪下整個側(cè)枝，形成直鏈淀粉的脫支酶。普魯蘭酶還可以分解普魯蘭多糖，普魯蘭酶來源于微生物，R-酶則來源于植物。普魯蘭酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通過產(chǎn)氣氣桿菌Aerobacter. aerogenes}(典型菌為肺炎克雷伯氏桿Klebsiella.pneumoniae)發(fā)酵獲得，他們報道了該酶良好的酶學性能。之后，各國的科研人員經(jīng)過廣泛深入研究，從不同的地區(qū)、微生物中獲得該酶，掀起了開發(fā)普魯蘭酶的高潮。
在淀粉加工工業(yè)中，α淀粉酶最為常用，它的功能是水解淀粉的α-1,4糖苷鍵，單獨用它時，產(chǎn)物中含有大量分支結(jié)構(gòu)的糊精，其中就含有大量的α-1,6糖苷鍵。假如不把淀粉的α-1,6糖苷鍵徹底分解的話，勢必會造成很大的浪費。自然界中，存在有能分解淀粉的α-1,6糖苷鍵的酶，通稱為解支酶。如寡α-1,6葡萄糖苷酶( E.C3.2.1.68, Oligo-l,6-glucosidase )，普魯蘭酶(E.C3.2.1.41Pullulanase )，異淀粉酶( E.C3.2.1.68, Isoamylose )，支鏈淀粉一6-葡聚糖酶( E.C3.2.1.69,Amylopectin-6-gluanohydrase )，其中普魯蘭酶要求的底物分子結(jié)構(gòu)最小，故而可以將最小單位的支鏈分解，導致可以最大限度的利用淀粉，所以在淀粉加工工業(yè)中有著重要的用途和良好的市場前景。故而許多國家都爭相開發(fā)，但是到現(xiàn)在為止，只有丹麥的NOVO公司具有普魯蘭酶的生產(chǎn)能力。我國只有向其進口，但是其價格昂貴，限制了普魯蘭酶在我國的應(yīng)用。其實，我國早在七十年代就開發(fā)普魯蘭酶的產(chǎn)生菌，但是該菌的酶學性質(zhì)不適合生產(chǎn)，至今我國在普魯蘭酶的國產(chǎn)化方面還沒有報道。
在淀粉的加工行業(yè)上，對普魯蘭酶的酶學性質(zhì)的要求是耐酸耐熱，其原因是因為通常使用外加酶化法，由于所用酶類的限制，普魯蘭酶的添加可以在兩步反應(yīng)的任何一步，但必須滿足上述的反應(yīng)的條件。因此所開發(fā)的普魯蘭酶的酶學性質(zhì)必須滿足現(xiàn)有的酶法水解制糖的條件，也就是耐酸耐熱。
二、普魯蘭酶的研究現(xiàn)狀
1.產(chǎn)普魯蘭酶的微生物
普魯蘭酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通過產(chǎn)氣桿菌(Aerobacter
aerogenes)發(fā)酵獲得。他們報道了該酶的良好性能之后，各國的科研人員經(jīng)過廣泛深入的研究，從不同的地區(qū)的微生物中獲得該酶，掀起了開發(fā)普魯蘭酶的高潮。但是迄今為止，盡管發(fā)現(xiàn)許多微生物能夠產(chǎn)普魯蘭酶，但是由于當今工業(yè)生產(chǎn)條件(酸性，溫度)，大多數(shù)微生物所產(chǎn)的普魯蘭酶并無商業(yè)價值。以下便介紹一下普魯蘭酶的生產(chǎn)菌種。
1.1蠟狀芽抱桿菌覃狀變種(Bacillus cereus Var.mycodes)
由日本的ToshiyukiTakasaki于1975年發(fā)現(xiàn)。該菌同時產(chǎn)生兩種淀粉酶:β-淀粉酶和普魯蘭酶。最佳作用條件為pH6～6.5，溫度50℃，最大轉(zhuǎn)化率(淀粉水解產(chǎn)生麥芽糖)大約為95%.酶學研究中發(fā)現(xiàn)，此酶在pH5，溫度60℃依然保持大部分活性，該菌的營養(yǎng)細胞呈棒桿狀，聚集成長短不等紊亂鏈狀，無運動性，格蘭氏陽性，產(chǎn)芽抱時細胞無明顯膨脹。該菌最適生長溫度30℃～37℃ ,最高生長溫度在41℃～45℃，可以利用葡萄糖，甘露糖，麥芽糖，海藻糖，淀粉和糖原。
1.2嗜酸性分解普魯蘭多糖芽抱桿菌(BaciIluS.Acidopullulyticus)
上世紀八十年代初，丹麥Novo公司獲得此菌，此菌所生產(chǎn)的普魯蘭酶耐熱
(60℃)，耐酸(pH4.5)。該公司經(jīng)過投入巨資開發(fā)研究，1983年Nov。公司在日本和歐洲市場同時商業(yè)化銷售，商品名Prornozyme。如今，它是應(yīng)用最廣，產(chǎn)量最大的普魯蘭酶。Bacillus.Acidopullrrlyticus呈棒狀，深層發(fā)酵幾小時后，可觀察到類原生質(zhì)體的膨脹細胞，較穩(wěn)定，飽子呈圓柱體或橢圓體。格蘭氏反應(yīng)陽性，37℃生長良好，45℃以上和pI-1高于6.5以上不長，在以普魯蘭糖為碳源的培養(yǎng)基((pH4.8 ～5.2)上生長良好。
1.3枯草芽飽桿菌(Bacillus subtilis)
1986年，日本的Yushiyuki Takasaki報道了一株能產(chǎn)生耐熱耐酸普魯蘭酶的菌種，被命名為Bacillus subtilis TU。此菌種所產(chǎn)生的酶為普魯蘭酶和淀粉酶的混合物，可水解淀粉為麥芽三糖和麥芽搪.水解普魯蘭糖為麥芽三糖，其中普魯蘭酶最佳作用pH為7.0～7.5，但在pH5.0時亦有約50%的酶活，此普魯蘭酶最佳作用溫度60℃。
1.4耐熱產(chǎn)硫梭菌(Clostridum Themosulfurogenes)
1987年.德國的E.madi等報道了一株能同時產(chǎn)a淀粉酶、普魯蘭酶和葡萄糖淀粉酶的菌種:耐熱產(chǎn)硫梭菌。該菌種所產(chǎn)普魯蘭酶有較廣的溫度適應(yīng)范圍(40℃～85℃)，在pH4.5～6.0有較高的活性，在如此廣的范圍內(nèi)都有較強活力無疑將擴大該普魯蘭酶的應(yīng)用領(lǐng)域.
1.5 Bacillusnaganoensis,Bacillus deramificans,Bacillus.Acidopullulyticus
上世紀九十年代，Deweer發(fā)現(xiàn)了普魯蘭酶產(chǎn)生菌Bacillus naganoensis;Tomimura篩選出Bacillus deramifrcans。這兩株菌所產(chǎn)的普魯蘭酶的酶學性質(zhì)與Bacillus. Acidopullulyticus的酶學性質(zhì)相似。這兩株菌都是中度嗜酸菌，在pH6.5以上就不生長，溫度超過45℃以上同樣也不生長。這兩株普魯蘭酶產(chǎn)生菌的發(fā)現(xiàn)，進一步拓寬了普魯蘭酶的應(yīng)用。
1.6產(chǎn)普魯蘭酶的高溫菌菌種
自上世紀八十年代以來，人們逐漸意識到在通常的自然條件下，很難篩選得到極端耐熱的普魯蘭酶生產(chǎn)菌種，于是各國的科學家便把目光轉(zhuǎn)移到溫泉嗜高溫細菌的篩選，而且現(xiàn)在已經(jīng)取得較多的成果。Bacillus如vorcaldarius所產(chǎn)普魯蘭酶的最適溫度和pH分別是75～85℃, pH6.3, Thermotoga maritime的最適溫度和pH分別是90℃, pH6.0, Thermurs caldopHilus的最適溫度和pH分別是75℃,pH5.5, Fenidobacterion pernnavoran最適溫度和pH分別是80～85℃, pH6.0o
2.普魯蘭酶的分子結(jié)構(gòu)
至今為止，許多普魯蘭酶的基因己經(jīng)被克隆，但是還沒有見到任何有關(guān)普魯蘭酶結(jié)構(gòu)的報道，但是在根據(jù)序列相似性對糖普鍵水解酶的分類，普魯蘭酶屬于第13家族，α淀粉酶家族，這個家族中包含了30多種酶，可以分為水解酶，轉(zhuǎn)移酶。異構(gòu)酶三大類。這些酶能夠水解和合成α～1.4,α～1.6,α～1.2,α～1.3,α～1.5,α～1.1糖苷鍵。其中很多酶的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被報道，它們都采取了(β/α)8的結(jié)構(gòu)，通過生物信息學的研究，這個家族的蛋白都有一個共同的結(jié)構(gòu)，酶的活性中心都是(β/α)8折疊筒的結(jié)構(gòu)，命名為結(jié)構(gòu)域A。第13家族的大多數(shù)酶還具有結(jié)構(gòu)域B，它是位于(β/α)8折疊筒中，第三個β片層與第三個α螺旋之間的一段序列，其特點是結(jié)構(gòu)和長度差異較大，推測其功能是與底物的結(jié)合有關(guān)。在緊接著(β/α)8折疊筒后，還有C結(jié)構(gòu)域，緊接C結(jié)構(gòu)域，部分家族成員還有結(jié)構(gòu)域D。
3.普魯蘭酶的應(yīng)用
普魯蘭酶，在食品工業(yè)中是一種用途廣泛的酶制劑和加工助劑。它能專一性分解淀粉中的支鏈淀粉和糖原分子及其衍生的低聚糖分支中的α～l, 6糖苷鍵，使分支結(jié)構(gòu)斷裂，形成長短不一的直鏈淀粉。因此，將該酶與其它淀粉酶配合使用時，可使淀粉糖化完全。近年來，普魯蘭酶己作為淀粉酶類中的一個新酶種，應(yīng)用于淀粉為原料的食品等工業(yè)部門，在食品工業(yè)中有如下幾方面的作用:
3.1單獨使用普魯蘭酶，使支鏈淀粉變?yōu)橹辨湹矸?/p>
直鏈淀粉具有凝結(jié)成塊，易形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的凝膠的特性，因此，可作為強韌的食品包裝薄膜。這種薄膜對氧和油脂有良好的隔絕性，又因涂布開展性好，故適合于作為食品的保護層。它還適合于淀粉軟糖制造，也可用作果醬增稠劑，用于裝油脂含量高的食品，以防止油的滲出以及肉食品加工。近年來在食品工業(yè)中提倡使用可被生物降解的薄膜，直鏈淀粉在這些方面具有較大的發(fā)展前途。豆類直鏈淀粉含量較高，因此綠豆淀粉制成的粉絲韌性比其它淀粉好，如果用普魯蘭酶處理谷物淀粉，再制成直鏈淀粉后，可以制成高質(zhì)量的粉絲。一般谷物淀粉中，直鏈淀粉含量僅占20%，支鏈淀粉含量約為80%。工業(yè)上每生產(chǎn)1噸直鏈淀粉就有4噸副產(chǎn)品的支鏈淀粉。美國雖然通過遺傳育種的方法.得到含直鏈淀粉60%玉米新品種，但不大適于大量生產(chǎn)。國外已采用普魯蘭酶改變淀粉結(jié)構(gòu)，可使支鏈淀粉變?yōu)橹辨湹矸?。?jù)報道，采用此法收率可達100%.制造直鏈淀粉的方法為，先采用普魯蘭酶分解經(jīng)液化的分支部分，使其轉(zhuǎn)變?yōu)橹辨湹矸?，并以丁醇或緩慢冷卻法沉淀淀粉。再回收含少量水分的晶型沉淀物，最后通過低溫噴霧干燥法制成粉狀的直鏈淀粉。
3.2普魯蘭酶與β～淀粉酶配合使用生產(chǎn)麥芽搪
飴糖是我國傳統(tǒng)的淀粉糖產(chǎn)品，其中所含部分麥芽糖，廣泛用于糖果、糕點等食品工業(yè)。目前生產(chǎn)方法是以α～淀粉酶進行液化，再用β～淀粉酶水解支鏈淀粉，這樣只能水解側(cè)鏈部分。接近交叉地位的α～1.6糖苷鍵時，水解反應(yīng)停止。但如果使用普魯蘭酶共同水解，便能使分支斷裂，提高淀粉酶水解程度，降低了β極限糊精的含量，大大提高了麥芽糖的產(chǎn)率，有利于生產(chǎn)麥芽搪漿。目前對加普魯蘭酶進行糖化己作了較大規(guī)模的試驗。
試驗條件為。每批投料量約為900公斤碎米，粉漿濃度為15～16Be°數(shù)皮用量1.5%(對碎米計)，β～淀粉酶活性2,000單位/克以上，pH5.8;普魯蘭酶活性45,000～55,0 00單位/克，系由產(chǎn)氣氣桿菌生產(chǎn)，每批用量為1公斤。試驗結(jié)果表明，加入普魯蘭酶糖化的試驗糖與對照糖品相比，還原糖平均增加14.8，麥芽糖含量平均增加了45.6，糊精含量平均減少了26.7高濃度麥芽糖漿較之高濃度葡萄搪漿，具有不易結(jié)晶，吸濕性小的特點，所以高濃度麥芽糖漿在食品工業(yè)中有著廣泛的用途。采用普魯蘭酶與p一淀粉酶配合使用，成本低廉，麥芽糖收率達到70%左右，其至更高。
3.3用于啤酒外加酶法糖化
啤酒生產(chǎn)中麥芽，既是釀造啤酒的主要原料，也為釀造過程提供了豐富的酶源。在啤酒釀造的糖化過程中，麥芽中分解淀粉的主要酶是α～淀粉酶、β～淀粉酶和分解淀粉α～1. 6糖瞥鍵的R一酶(植物普魯蘭酶或植物茁霉多糖酶)。β～淀粉酶與另兩種淀粉酶協(xié)同作用，可使淀粉分解成麥芽糖(也包括少量的麥芽三糖和極少量的葡萄糖)和低分子糊精。使麥芽汁有比較理想的糖類組成。在工業(yè)生產(chǎn)中為了節(jié)約麥芽用量，采用所謂外加酶法糖化，即在減少麥芽用量的前提下，增加淀粉質(zhì)輔助原料的比率，并加入適當種類的酶制劑進行搪化。要使大麥及其它輔助原料糖化完全，需要外加a一淀粉酶和分解α～1.6糖苷鍵的普魯蘭酶制劑等。單獨使用a一淀粉酶時產(chǎn)生麥芽糖和麥芽三搪是很不完全的。假如分解淀粉α～1.6糖苷鍵的酶活性不足，淀粉分解就不完全，其結(jié)果是可發(fā)酵性糖含量低，制成的啤酒發(fā)酵度達不到要求。若采用能分解α～1.4和α～1.6糖苷鍵的糖化型淀粉酶，則其反應(yīng)產(chǎn)物為葡萄糖，容易使酒味淡薄。采用普魯蘭酶與α～淀粉酶協(xié)同，效果良好，其分解產(chǎn)物主要是麥芽糖和少量的麥芽多糖。采用外加酶法糖化時，加入酶制劑的用量為:淀粉酶6～7單位/克大麥及大米:蛋白酶，60-80單位/克，并配合以菠蘿蛋白酶10ppm，普魯蘭酶50單位/克大麥。以上三種酶制劑均添加于糖化或酒化開始。
總之，普魯蘭酶無論作為酶制劑和食品工業(yè)的加工助劑均有廣闊的發(fā)展前途。
研究目的和意義：
酶制劑工業(yè)是上世紀七十年代就己經(jīng)形成的一個重要的產(chǎn)業(yè)，目前世界酶制劑總產(chǎn)值達100億美元，我國的產(chǎn)值約為100億人民幣，并且隨著其應(yīng)用領(lǐng)域的不斷擴大以及新酶種的開發(fā)，這一市場正在迅猛發(fā)展。但是全球酶制劑產(chǎn)業(yè)幾乎被幾家外國公司所壟斷，其中丹麥的NOVO公司幾乎占全球總銷售額的一半。本研究對普魯蘭酶的開發(fā)，對酶制劑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有重要的意義。
其次我國自從七十年代開始便對普魯蘭酶進行研究開發(fā)，但是所開發(fā)得到的普魯蘭酶，既不耐熱也不耐酸，這就使其在工業(yè)化應(yīng)用中受到了局限。為了改變我國對進口產(chǎn)品的依賴，填補我國這一領(lǐng)域的空白，尋找一條國產(chǎn)化的道路，本研究的目的是利用自然微生物資源，普魯蘭酶，提高我國淀粉原料的利用率，從而提高整個淀粉加工行業(yè)的生產(chǎn)率，這對我國淀粉加工產(chǎn)業(yè)的意義是不言而喻的。
研究內(nèi)容(內(nèi)容、結(jié)構(gòu)框架以及重點、難點)：
一.普魯蘭酶產(chǎn)生菌的篩選
(1)樣品的采集;
(2)菌種初篩;
(3)菌種復篩;
(4)菌種保藏方法;
(5)酶活力測定方法的建立。
二.產(chǎn)普魯蘭酶菌株的產(chǎn)酶條件的研究
(1)碳源，氮源對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響;
(2)初始PH對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響;
(3)接種量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響;
(4)發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響;
(5)金屬離子對產(chǎn)酶的影響。
重點或關(guān)鍵技術(shù)：
(1)純菌株的分離;
(2)菌株的鑒定方法的選擇。
研究方法、手段：
一.普魯蘭酶產(chǎn)生菌的篩選
(1)樣品的采集：選擇適合產(chǎn)生的地點(面粉廠.菜地.果園等)采集土樣
(2)菌種初篩：在采集的土樣用無菌水稀釋后，在含有淀粉類的培養(yǎng)基中做平板涂步， 37℃培養(yǎng)48h后，用碘液進行顯色反應(yīng)，將有淀粉酶產(chǎn)生的菌落接于斜面中保存。
(3)菌種復篩：將前期分離的能產(chǎn)生淀粉酶的菌株涂步于普魯蘭糖平板上，37℃培養(yǎng)48h后用95%乙醇進行透明圈實驗。有透明圈產(chǎn)生說明菌株產(chǎn)生普魯蘭酶，將產(chǎn)生透明圈的菌落挑于斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)。
(4)菌種保藏方法： 采用4℃低溫保藏。
(5)酶活力測定方法的建立：采用發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)過離心后利用DNS顯色法 520nm測定吸光值，測定標準葡萄糖標準曲線，利用標準曲線計算普魯蘭酶酶活大小。
二.產(chǎn)普魯蘭酶菌株的產(chǎn)酶條件的研究
(1)碳源，氮源對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：采用不同碳源，氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時間，測定酶活力。(其他條件相同：接種量，裝瓶量，初始PH值，轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)時間。)
(2)初始PH對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：采用相同發(fā)酵培養(yǎng)基，在不同初始PH下接種等量種子液。在相同條件下培養(yǎng)，測定發(fā)酵液的酶活。(其他條件相同：接種量，裝瓶量，轉(zhuǎn)速，最佳培養(yǎng)溫度，最佳培養(yǎng)時間。)
(3)接種量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響：在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別接入2%，4%，6%，8%，
10%，14%，18%的種子培養(yǎng)液于最佳碳源，氮源，最佳初始PH的培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)，分別檢測酶活。(采用以上確定的最佳碳源，氮源，最佳初始PH。)
(4)發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響：采用相同培養(yǎng)基，在不同溫度下(25℃，30℃，35℃，40℃，45℃)培養(yǎng)一定時間，測定酶活力。
(5)金屬離子對產(chǎn)酶的影響：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入少量不同金屬離子，發(fā)酵后測酶活。(金屬離子有： 錳離子，鈣離子，鋅離子，鎂離子，鐵離子，銅離子。)
研究進度
?。和瓿身椖靠傮w進度30%，樣品土樣的采集及前期的準備工作,菌株的初篩，包括(樣品土樣原液的涂步培養(yǎng)及搖床培養(yǎng)，產(chǎn)支鏈淀粉酶菌株的挑選及斜面培養(yǎng))。
?。和瓿身椖靠傮w進度50%,菌株的復篩，包括(產(chǎn)普魯蘭酶菌株的篩選及斜面培養(yǎng)),葡萄糖標準曲線的測定,酶活測定方法的建立,并以酶活大小對菌株進行再次篩選。
：完成項目總體進度80%,產(chǎn)酶條件的研究。包括：碳源，氮源，初始PH值，接種量，發(fā)酵溫度，金屬離子。并通過各中單因素試驗確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源，氮源，初始PH值，接種量，發(fā)酵溫度，金屬離子。
2009、4—2009、5 ：完成項目總體進度100%,課題總結(jié)，撰寫論文。
文獻綜述(包括：國內(nèi)外研究理論、研究方法、進展情況、存在問題、參考依據(jù)等)
自從1961年Bender H.等人在研究一株產(chǎn)氣氣桿菌Aerobacter aerogenes(典型菌為肺炎克雷伯氏桿菌Klebsiella.pneumoniae)時首次發(fā)現(xiàn)普魯蘭酶后，國際上對產(chǎn)生這種酶的微生物進行了廣泛研究，發(fā)現(xiàn)許多微生物可以產(chǎn)生此酶，并篩選出一些適用于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)良菌株。隨著該酶的應(yīng)用發(fā)展，對耐熱性普魯蘭酶的研究也逐漸增多，已成功克隆并表達了該酶的基因。國內(nèi)1976年開始對一株產(chǎn)氣氣桿菌(Aerobacteraerogenes 10016)的普魯蘭酶進行研究，對該菌株的產(chǎn)酶條件、酶的分離提取及酶學性質(zhì)作了報道，并研究了該酶的食品級提取技術(shù)。此外，陳朝銀、劉濤等人從云南溫泉水樣中篩選到一株產(chǎn)普魯蘭酶高溫棲熱菌菌株，通過誘導等實驗將該酶的酶活從0.069u/mL提高到170u/mL，酶產(chǎn)量提高了近2500倍左右，酶的最適作用溫度及pH分別是75℃和4.5，具有一定的耐熱和耐酸特性。
陳金全等從溫泉水樣中篩選到一株產(chǎn)耐熱耐酸普魯蘭酶的野生菌株，并根據(jù)形態(tài)、生理生化特征、細胞化學組分分析及16SrDNA序列比對、基因組DNA的G+C摩爾百分含量、同源性比對等實驗，鑒定其為脂環(huán)酸芽抱桿菌屬(Alicyclobacillus)的一個新種，所產(chǎn)酶最適作用溫度為60℃，最適pH值4.0，具有較好的耐熱耐酸特性。楊云娟等利用畢赤酵母成功構(gòu)建了普魯蘭酶表達量較高的基因工程菌，搖瓶發(fā)酵酶活可達350.8U/mL，最佳發(fā)酵條件下產(chǎn)量可達504.5-510.1U/mL .酶的最適作用溫度為600C，最適pH值4.5，具有較好的耐熱耐酸性。目前我國仍沒有具備獨立生產(chǎn)普魯蘭酶能力的廠商，要實現(xiàn)低成本、國產(chǎn)化的生產(chǎn)，還有很長的路要走。
技術(shù)應(yīng)用于耐熱脫支酶的研究，使耐熱異淀粉酶的研究有了很大發(fā)展。Coleman等人將嗜熱厭氧菌T. brockii普魯蘭酶基因克隆到B.subtilis中得到的克隆子分泌的普魯蘭酶數(shù)量高于出發(fā)菌株，Okada等人將Bacillus Steanther, onhiu:中編碼熱穩(wěn)定異淀粉酶的基因克隆到B.subtilu:中，得到的轉(zhuǎn)化菌株其異淀粉酶能在60 ℃穩(wěn)定15分鐘。Burchadf將。ostridium thermosulf urogenes DSM38%的嗜熱異淀粉酶基因克隆并在E.coli中表達，所得酶的最適pH和最適溫度與出發(fā)菌相同，而且在高溫下仍能保持活性.Antranikiam等人將Pyrococcus舟riousous的異淀粉酶基因克隆到E.coli中并分離得到了酶蛋白。盡管如此，目前尚未有已將轉(zhuǎn)基因的耐熱性異淀粉酶工程菌應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中的報道。眾所周知，利用物理和化學誘變劑單獨或復合處理微生物細胞是選育高產(chǎn)變種菌株行之有效的經(jīng)典方法，它在為培育多種抗生素、氨基酸、核苷酸激酶(尤其是蛋白酶和淀粉酶)的高產(chǎn)變種菌株方面曾經(jīng)起過極為重要的作用，至今仍然是方便易行和行之有效的方法之一。
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