醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)的論文的范文精選
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談補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)大鼠局灶性腦缺血損傷血腦屏障的影響
腦血管疾病是當(dāng)前導(dǎo)致人類(lèi)死亡和殘障的主要原因之一,其中80%左右為缺血性腦血管疾病,且有逐年上升和年輕化的趨勢(shì)。補(bǔ)陽(yáng)還五湯為清代名醫(yī)王清任所創(chuàng)的中醫(yī)經(jīng)典方劑,原方載于《醫(yī)林改錯(cuò)下卷癱痿論》,是治療半身不遂、癱痿不用諸癥的首選方。前期研究表明,補(bǔ)陽(yáng)還五湯可擴(kuò)張腦血管、改善腦循環(huán)、對(duì)抗腦缺血后興奮性氨基酸的毒性等。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠大腦中動(dòng)脈阻斷(MCAO)模型,觀察補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)血清中血管性血友病因子(vWF)及腦組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9 表達(dá)的影響,進(jìn)一步闡述該方抗腦缺血的機(jī)理。
1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1 動(dòng)物
健康雄性SPF 級(jí)SD 大鼠64 只,12 周齡,體質(zhì)量(28020)g,購(gòu)于中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心,許可證號(hào)：SCXK(軍)2004-2009。
1.2 藥物與試劑
補(bǔ)陽(yáng)還五湯由黃芪120 g、當(dāng)歸6 g、川芎3 g、地龍3 g、赤芍5 g、紅花3 g、桃仁3 g 組成,北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供,經(jīng)水煎、濃縮制成1 g 原藥材/mL的溶液; 2,3,5- 三苯基氯化四氮唑(TTC) ： 美國(guó)(aMResco 公司,批號(hào)0765)。大鼠MMP-2、MMP-9、VEGF、vWF ELISA 試劑盒：美國(guó)RB 公司,規(guī)格96T,購(gòu)于北京尚柏試劑有限公司(批號(hào)分別為63120912、28120811、27121009、52121203)。
1.3 主要儀器
電子分析天平(AE160 型,瑞士Mettler 公司),手術(shù)顯微鏡(SXP-1B,上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠),1411 型高頻小電刀(上海醫(yī)療器械技術(shù)公司),低溫高速離心機(jī)(Sigma 公司),光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS 公司),切片掃描儀(蔡司光學(xué)儀器有限公司),顯微圖像分析系統(tǒng)(日本尼康公司)。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 造模
根據(jù)Longa 等報(bào)道的線栓法建立大鼠永久性腦缺血模型。10%水合氯醛溶液(0.35 mg/kg 體質(zhì)量)腹腔注射麻醉后將大鼠仰位固定,常規(guī)碘酒、酒精消毒頸部皮膚。頸部正中作約2.5 cm 切口,暴露左側(cè)頸動(dòng)脈三角,在手術(shù)顯微鏡下逐層分離組織,剝離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。電刀凝閉ECA 的分支甲狀腺動(dòng)脈、ECA 與ICA 之間的枕動(dòng)脈,結(jié)扎游離ECA 主干,分離ICA 主干至翼腭動(dòng)脈(PPA),用無(wú)損動(dòng)脈夾分別夾閉CCA、ICA 和PPA,用虹膜剪在ECA 殘端剪一楔形小口,由此插入釣魚(yú)線(直徑0.25 mm,頭端呈直徑約0.3 mm 的圓球形),輕推釣魚(yú)線使之由ECA 通過(guò)分叉部進(jìn)入ICA,至大腦中動(dòng)脈的起點(diǎn),阻斷大腦中動(dòng)脈的血液供應(yīng)。尼龍線插入深度由分叉處計(jì)算約18～22 mm?？p合頸部切口,假手術(shù)組手術(shù)過(guò)程與模型組相同,分離出左側(cè)CCA 及ECA、ICA,僅結(jié)扎ECA。用縫合線結(jié)扎ECA 殘端,剪斷多余栓線,術(shù)區(qū)使用青霉素粉少許,逐層縫合手術(shù)切口。待清醒后,參照Bedersont 等的評(píng)分方法,3 分者為造模成功。假手術(shù)組手術(shù)過(guò)程與模型組相同,但只結(jié)扎ECA遠(yuǎn)心端,不插入栓線阻塞血管。
2.2 分組與給藥將造模成功的大鼠按照神經(jīng)功能評(píng)分均勻分組,分為模型組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯組。補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠給予補(bǔ)陽(yáng)還五湯水煎液,給藥劑量為1.26 g 原藥材/100 g體質(zhì)量(相當(dāng)于臨床成人日用量的6.3 倍),造模后24 h 立即灌胃,之后每日稱大鼠體質(zhì)量,計(jì)算給藥量,于相同時(shí)間點(diǎn)給藥1 次;假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水。連續(xù)給藥6 d,第7 日進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分并處死取材。2.3 檢測(cè)方法及觀察指標(biāo)2.3.1 神經(jīng)功能評(píng)分 參考Bederson 等方法,總分10 分。
①提鼠尾,觀察右前肢表現(xiàn)。1 分：內(nèi)收,但不貼身;2 分：內(nèi)收,貼于身體;3 分：內(nèi)收貼于身體并踡縮;4 分：大鼠軀體向右側(cè)旋轉(zhuǎn)。
?、谠u(píng)價(jià)兩前肢肌張力：將動(dòng)物置于一金屬網(wǎng)上,向后輕提鼠尾,觀察兩側(cè)前肢肌張力。0 分：兩側(cè)前肢緊拉金屬網(wǎng)肌力無(wú)明顯差別者;1 分：右前肢拉金屬網(wǎng)但肌力明顯弱于左側(cè);2 分：右前肢不能拉金屬網(wǎng)。
?、蹖?dòng)物置一光滑平面,觀察側(cè)向推擋阻力。0 分：雙側(cè)推擋阻力無(wú)明顯差別;1 分：右側(cè)推擋阻力明顯弱于左側(cè);2 分：右推大鼠時(shí)其向右側(cè)傾倒。
?、艽笫笞笱凵喜€下垂,左眼分泌物增多者評(píng)2 分。以上4 項(xiàng)評(píng)分相加為最后神經(jīng)功能評(píng)分。
2.3.2 大鼠腦梗死體積檢測(cè)
造模后第7 日,將麻醉大鼠斷頭取全腦后迅速放于-20 ℃冰箱中凍存15 min后,距額極2 mm 開(kāi)始,以視交叉水平為中心,間隔2 mm做連續(xù)冠狀切片,每個(gè)腦塊切5 片,迅速投入5 mL1%TTC 溶液中,置37 ℃孵箱孵育30 min,避光。正常腦組織染成紅色,缺血區(qū)呈灰白色。TTC 染色均勻后取出腦組織,放置于盛有4%多聚甲醛液的小瓶?jī)?nèi),固定24 h,取出后濾紙吸干表面水分,用掃描儀掃出圖片,計(jì)算梗死體積占大腦半球體積的百分比。
2.3.3 大鼠腦組織及微血管的形態(tài)觀察
造模后第7 日,大鼠灌注后斷頭取腦,置于4 ℃、4%中性多聚甲醛固定液(pH 7.2～7.6)固定24 h 后,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋,于視交叉前緣開(kāi)始作5 m 厚冠狀切片。常規(guī)脫蠟水化,行HE 染色,中性樹(shù)膠封片。光鏡下觀察腦組織及微血管形態(tài)學(xué)改變。
2.3.4 大鼠血清中血管性血友病因子及腦組織中基
質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的含量測(cè)定 造模后第7 日,將動(dòng)物麻醉,自腹主動(dòng)脈采血,靜置30 min 后離心取上清凍存?zhèn)溆?。再取腦分離出左側(cè)(患側(cè))半球放于凍存管置液氮中,檢測(cè)前以生理鹽水制成10%腦組織勻漿。取制備好的血清及腦組織勻漿,按照試劑盒說(shuō)明操作。
3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以xs 表示,數(shù)據(jù)資料經(jīng)正態(tài)性分布檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)后,采用方差或非參數(shù)檢驗(yàn)比較組間差異。P 0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)意義。
4 結(jié)果
4.1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響
動(dòng)物蘇醒后,模型組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯組都存在明顯神經(jīng)功能缺損,神經(jīng)功能評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 假手術(shù)組未見(jiàn)神經(jīng)功能缺損。灌胃6 d 后,模型組神經(jīng)功能評(píng)分略增高,但前后比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低,與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P 0.01),提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠促進(jìn)大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù),減輕缺損程度。各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分。
4.2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)大鼠腦梗死體積的影響
TTC 染色結(jié)果表明,假手術(shù)組腦片均紅染,無(wú)白色梗死灶形成。模型組大鼠梗死灶位于缺血側(cè)腦組織基底節(jié)區(qū)和額頂部外側(cè)皮層,腦梗死灶明顯。補(bǔ)陽(yáng)還五湯組腦梗死體積顯著減小,與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.05)。
4.3 病理觀察結(jié)果
假手術(shù)組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)完整,灰白質(zhì)邊界清楚,皮質(zhì)各層細(xì)胞分布基本正常;神經(jīng)元排列整齊且形態(tài)多樣,胞核較大、居中、著色淺、核仁清晰、胞質(zhì)深染;腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、連接緊密,未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、充血及水腫。模型組腦組織可見(jiàn)梗死灶,灶內(nèi)結(jié)構(gòu)疏松,呈水腫樣,神經(jīng)元丟失明顯,殘存的神經(jīng)元細(xì)胞核固縮、濃染;腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞受損,可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn),嵌塞。補(bǔ)陽(yáng)還五湯組腦組織病理變化較模型組減輕,梗死灶體積較模型組縮小,水腫情況減輕;存活的神經(jīng)元數(shù)目有所增加,血管內(nèi)皮細(xì)胞受損較模型組減輕,有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);半暗區(qū)損傷亦有所改善。
4.4 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)大鼠血清中血管性血友病因子及腦組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子含量的影響
與假手術(shù)組比較,模型組VEGF、MMP-2、MMP-9 及vWF 含量顯著增加(P 0.01,P 與模型組比較,補(bǔ)陽(yáng)還五湯組VEGF、vWF、MMP-9 及MMP-2 含量顯著降低(P 0.01,P 0.001)。提示腦缺血7 d 后,模型組腦組織中VEGF、MMP-2、MMP-9 及血清中vWF 均增高,補(bǔ)陽(yáng)還五湯能阻抑其表達(dá)。
5 討論
現(xiàn)代研究表明,補(bǔ)陽(yáng)還五湯可增強(qiáng)微血管應(yīng)激能力,緩解微血管痙攣,減輕其損傷程度,使微血管密度及微血管面積比增加,減輕缺血損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,給永久性腦缺血?jiǎng)游镅a(bǔ)陽(yáng)還五湯后,神經(jīng)功能缺損明顯改善,腦梗死體積顯著減小。血腦屏障破壞可導(dǎo)致血管源性腦水腫和腦疝的發(fā)生,造成病情的惡化。
故減輕缺血對(duì)血腦屏障造成的損傷,保護(hù)腦組織,成為治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。腦組織中細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是維持血腦屏障結(jié)構(gòu)完整性的重要組成部分,而MMPs 激活后能夠降解ECM 成分。MMPs 是一組Zn2+、Ca2+依賴性的蛋白水解酶,正常時(shí)以酶原形式存在,在一些生理和病理?xiàng)l件下被激活,參與組織的損傷和修復(fù)。在腦缺血損傷中起重要作用的是MMP-2 和MMP-9,可降解ECM、破壞腦血管外基底膜主要成分,從而破壞血腦屏障、改變毛細(xì)血管通透性導(dǎo)致血管源性腦水腫甚至出血性轉(zhuǎn)化,還可使炎性細(xì)胞浸潤(rùn)至腦組織,引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)。腦缺血后MMP-2 表達(dá)增加與早期神經(jīng)元的損傷有關(guān),MMP-9 表達(dá)增加與腦梗死后出血轉(zhuǎn)化有關(guān)。MMP-9 水平的上升出現(xiàn)在缺血性腦卒中早期或急性期,導(dǎo)致血腦屏障的破壞,進(jìn)一步促使神經(jīng)炎癥反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞的繼發(fā)性死亡。Higashida J 等研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)提高缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)、水通道蛋白4(AQP4)、MMP-9 的表達(dá)可以降低血管基底膜蛋白表達(dá)和緊密連接蛋白的表達(dá),加重腦水腫,通過(guò)抑制HIF-1、MMP-9 的表達(dá),降低血腦屏障的通透性,但不受AQP4 的影響。Romanic 等[6]則發(fā)現(xiàn)應(yīng)用MMP-9 單克隆抗體,梗死灶縮小了29.9%。因此我們推測(cè),早期選擇性抑制MMP-2、MMP-9 可顯著減輕腦梗死。
本實(shí)驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)了腦組織中MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)情況,在假手術(shù)組僅有少量表達(dá),與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[9-10],腦缺血后MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)量顯著增加,應(yīng)用補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)后,二者水平均顯著下降,提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以通過(guò)抑制MMP-2、MMP-9 表達(dá),保護(hù)血腦屏障,減輕腦損傷。內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成血腦屏障的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。循環(huán)中的vWF 主要來(lái)自血管內(nèi)皮細(xì)胞,內(nèi)皮細(xì)胞受損則合成和釋放vWF 增加,內(nèi)皮細(xì)胞損傷越嚴(yán)重,則血漿中vWF 水平越高。vWF 可加速血小板黏附、聚集,介導(dǎo)血小板釋放相關(guān)因子,干擾纖溶過(guò)程,促進(jìn)血管平滑纖維化、動(dòng)脈粥樣斑塊及血栓形成,且與疾病的輕重呈正相關(guān)。因此,vWF 被認(rèn)為是心血管疾病的一個(gè)高危因素,并被作為血管內(nèi)皮細(xì)胞損害的標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)?zāi)X缺血后大鼠血清中vWF 表達(dá)增高,補(bǔ)陽(yáng)還五湯顯著減少了其表達(dá),說(shuō)明補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞,從而維持血腦屏障結(jié)構(gòu)的完整性。
VEGF 是另一種特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能因子,是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的促有絲分裂源,能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖增生和轉(zhuǎn)移,它在血管生成的各個(gè)階段均發(fā)揮著重要作用,是目前公認(rèn)的血管新生中最關(guān)鍵的因子。本實(shí)驗(yàn)假手術(shù)組VEGF 有少量表達(dá),模型組VEGF 表達(dá)量增高,這可能是缺血性腦損傷誘導(dǎo)VEGF 基因早期表達(dá)的緣故;應(yīng)用補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)后,VEGF 顯著降低,筆者認(rèn)為,這可能和VEGF 的動(dòng)態(tài)表達(dá)有關(guān)。因此,可以推測(cè),補(bǔ)陽(yáng)還五湯可通過(guò)多環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)VEGF,保護(hù)血腦屏障。
目前,西醫(yī)治療腦缺血及其后遺癥尚無(wú)突破性進(jìn)展,而中醫(yī)藥防治腦缺血具有很大潛力。本實(shí)驗(yàn)顯示,補(bǔ)陽(yáng)還五湯能改善神經(jīng)功能缺損,減少腦梗死體積,其發(fā)揮作用的機(jī)理可能是通過(guò)抑制MMP-9、MMP-2、vWF的表達(dá)而保護(hù)血腦屏障,也可能是通過(guò)調(diào)控VEGF、vWF等內(nèi)皮活性因子,改善微循環(huán),促進(jìn)腦血流的恢復(fù)。
談不同比例士的寧對(duì)馬錢(qián)子堿體外經(jīng)皮滲透性質(zhì)的影響
馬錢(qián)子又名番木鱉，為馬錢(qián)科馬錢(qián)屬植物馬錢(qián)(Strychnosnux-vomica L.)或云南馬錢(qián)(S.pierriana A.W. Hill)的干燥成熟種子，主要有效成分為生物堿類(lèi)。包括士的寧、馬錢(qián)子堿、士的寧氮氧化物、馬錢(qián)子堿氮氧化物、異馬錢(qián)子堿、偽馬錢(qián)子堿等，約占總量1%-5%。其中士的寧和馬錢(qián)子堿約占總生物堿的70%。馬錢(qián)子生物堿作用于免疫、神經(jīng)、心血管等系統(tǒng)，具有抗炎及免疫、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等顯著療效。主要有效成分馬錢(qián)子堿具有很強(qiáng)的抗炎鎮(zhèn)痛和關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞增殖抑制作用，而士的寧在抗炎鎮(zhèn)痛方面活性較差，且毒性較強(qiáng)，其口服中毒量是馬錢(qián)子堿的1/71。因此馬錢(qián)子制劑中士的寧的含量會(huì)直接影響制劑的藥效及毒性。
研究表明，馬錢(qián)子制成經(jīng)皮給藥制劑對(duì)風(fēng)濕痹癥等具有較好療效，但其毒性，尤其是士的寧是亟待解決的問(wèn)題之一。為達(dá)到治療的增效減毒，本實(shí)驗(yàn)利用體外經(jīng)皮擴(kuò)散方法，探討士的寧與馬錢(qián)子堿在不同比例下，馬錢(qián)子堿的經(jīng)皮擴(kuò)散行為，為馬錢(qián)子的炮制及其經(jīng)皮制劑的研究等應(yīng)用方面提供參考依據(jù)。
材料
1. 動(dòng)物
清潔級(jí)雄性ICR小鼠30只，體質(zhì)量(20.03.0)g，浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(浙)2008-0033。
2. 儀器
1200 Agilent高效液相色譜(美國(guó)Agilent公司);RYJ-12B藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀(上海黃海藥檢儀器有限公司);XS205電子微量天平(瑞士Mettler Toledo公司);STARTER2100酸度計(jì)(美國(guó)OHAUS公司)。
3. 試藥
馬錢(qián)子堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110706-200505，純度95.9%);士的寧對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110705-200306，純度97%);馬錢(qián)子堿純品(南京澤朗植提技術(shù)有限公司，批號(hào)：ZL110116，純度97.2%);士的寧純品(南京澤朗植提技術(shù)有限公司，批號(hào)：ZL110120，純度96.2%);馬錢(qián)子購(gòu)于杭州華東中藥飲片有限公司，批號(hào)：101011，經(jīng)該公司質(zhì)檢科鄭霄鷹主管藥師鑒定為馬錢(qián)科植物馬錢(qián)子(Strychnos nux-vomica.L.)的干燥成熟種子;馬錢(qián)子總生物堿提取物1(自制，批號(hào)：20120608，馬錢(qián)子堿含量94.1%);馬錢(qián)子總生物堿提取物2(自制，批號(hào)：20120828，馬錢(qián)子堿含量27.01%，士的寧含量2 6 .95%，總生物堿含量67.38%)。乙腈(美國(guó)Tedia公司，批號(hào)：14035045，色譜純);其他試劑均為分析純。
方法
1. 透皮接受液中馬錢(qián)子堿、士的寧的含量測(cè)定方法研究
1.1 色譜條件
色譜柱：Agilent SB-C18柱(4.6mm150mm，5流動(dòng)相：乙腈-0.01moL/L庚烷磺酸鈉與0.02moL/L磷酸二氫鉀等量混合(10%磷酸調(diào)pH值為2.80)(21∶79);流速：1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm;進(jìn)樣量：20柱溫：室溫。
1.2 對(duì)照品溶液的制備
精密稱量馬錢(qián)子堿、士的寧對(duì)照品適量，甲醇溶解，流動(dòng)相稀釋至濃度分別為38.80、45.20g/mL。
1.3 供試品溶液的制備
取透皮接受液，0.45m微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。
1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線
取1.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣5、10、15、20、30、40、50、60L，在上述色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)。相應(yīng)對(duì)照品峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到馬錢(qián)子堿回歸方程Y=1 767.7X-39 093，r=0.9999，馬錢(qián)子堿在0.194-2.328g內(nèi)線性關(guān)系良好。得到士的寧回歸方程Y=2 352.3X-2 9943，r=0.9929，士的寧在0.226-2.712g內(nèi)線性關(guān)系良好。
1.5 儀器精密度試驗(yàn)
精密吸取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積的RSD值分別為0.19%，0.18%，說(shuō)明儀器精密度良好。
1.6 重復(fù)性試驗(yàn)
平行制備供試品溶液6份，進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算馬錢(qián)子堿和士的寧的RSD值均為0.32%。說(shuō)明此方法的重復(fù)性良好。
1.7 加樣回收率試驗(yàn)
精密量取已知含量馬錢(qián)子堿18.79g/mL，士的寧3.57g /mL的上述供試品溶液6份，每份0.5mL，各加0.2mL混合對(duì)照品溶液，流動(dòng)相定容至2mL，在上述色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。測(cè)得馬錢(qián)子堿和士的寧的平均回收率為96.74%，99.28%，RSD值分別為0.99%，0.55%(n=6)。說(shuō)明此方法準(zhǔn)確度良好。
1.8 樣品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)
取上述供試品溶液置于37℃條件下(n=6)，24h后測(cè)定含量，馬錢(qián)子堿、士的寧的RSD值分別為1.17%和1.52%，表明在37℃條件下透皮接受液中馬錢(qián)子堿和士的寧在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2. 體外經(jīng)皮吸收實(shí)驗(yàn)
2.1 接受介質(zhì)的配制
稱取氯化鈉8.00g，氯化鉀0.20g，磷酸氫二鈉3.63g，磷酸二氫鉀0.2 4g，加蒸餾水溶解定容至1 0 0 0mL，即得pH值7.40磷酸鹽緩沖液(PBS)。量取80 0mLPBS加入200mL無(wú)水乙醇，混勻，即得20%乙醇的PBS溶液。
2.2 樣品溶液的配制
馬錢(qián)子堿溶液的配制：精密稱取馬錢(qián)子堿純品適量，接受介質(zhì)溶解稀釋至濃度為1.56mg/mL。士的寧溶液的配制：精密稱取士的寧純品適量，接受介質(zhì)溶解稀釋至濃度為0.48mg/mL。馬錢(qián)子總生物堿提取物1溶液的配制：精密稱取馬錢(qián)子總生物堿提取物1適量，接受介質(zhì)溶解稀釋至馬錢(qián)子堿濃度為1.62mg/mL。馬錢(qián)子總生物堿提取物2溶液的配制：精密稱取馬錢(qián)子總生物堿提取物適量，接受介質(zhì)溶解稀釋至馬錢(qián)子堿濃度為0.829mg/mL，士的寧濃度為0.797mg/mL。按一定比例吸取上述馬錢(qián)子堿、士的寧溶液，制得不同比例的純品組;馬錢(qián)子總生物堿提取物1溶液中加入適量馬錢(qián)子總生物堿提取物2溶液，制得不同比例的提取物組。
2.3 離體皮膚的制備
取雄性健康小鼠，用7%硫化鈉溶液(含5%甘油)活體脫去其背部毛發(fā)后0.9%氯化鈉溶液洗凈皮膚，擦干后飼養(yǎng)12h。處死后剝離背部皮膚，剔除皮下脂肪和黏連物，0.9%氯化鈉溶液洗凈，待用。
2.4 離體透皮實(shí)驗(yàn)
將小鼠皮膚自然固定在改良的Franz擴(kuò)散池兩室之間，皮膚角質(zhì)層朝向供藥室，有效擴(kuò)散面積為2.8cm2，接受室容積為6.5mL。接受室中加入37℃預(yù)熱的接受介質(zhì)，皮膚與接受液間緊密貼合，排盡氣泡。供藥室中分別加入0.5mL上述比例的純品組和提取物組溶液，(37.01.0)℃恒溫水浴加熱，以600r/min磁力恒速攪拌。分別于給藥后2、4、6、8、10、12、24h取樣5mL，并補(bǔ)加5mL 37℃預(yù)熱的新鮮接受介質(zhì)。HPLC法測(cè)定馬錢(qián)子堿，士的寧含量。根據(jù)各取樣點(diǎn)接受液中馬錢(qián)子堿，士的寧含量，計(jì)算單位面積藥物累積透過(guò)量(Q)及穩(wěn)態(tài)滲透速率(J)。Q計(jì)算公式如下：Q=(V0Cn+Vn-1i-1Ci)/A (1)其中Q為單位面積累積透過(guò)量(A為有效透皮吸收面積(cm2);V0為接受液體積(mL);V為取樣體積(mL);Ci、Cn為第i(in-1)、n個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得接受液中藥物濃度(g/mL)。并按公式(2)計(jì)算累計(jì)透過(guò)百分率Q%。Q%=QA/QT (2)其中QT為上樣的總藥量(g)。
結(jié)果
1. 馬錢(qián)子堿的透皮結(jié)果
馬錢(qián)子堿在純品組及提取物組中透皮累積滲透曲線。透皮速率及累積透過(guò)百分率。隨著士的寧比例的增加，純品組及提取物中組馬錢(qián)子堿的J及Q%依次減小。當(dāng)比例為1∶0.6，提取物組與純品組進(jìn)行比較，Q%明顯升高(P0.05)，J增大，說(shuō)明可能其他生物堿的存在對(duì)馬錢(qián)子堿的透過(guò)有一定的影響。
2 . 士的寧的透皮結(jié)果
士的寧在純品組及提取物組中透皮累積滲透曲線。透皮速率及累積透過(guò)百分率。
討論
本研究發(fā)現(xiàn)：隨著士的寧比例的增大，士的寧的J與Q%逐漸升高，而馬錢(qián)子堿的J與Q%隨之降低。說(shuō)明提取物或混合物中士的寧均可抑制馬錢(qián)子堿的透皮吸收性能，且隨著士的寧比例的增大抑制效果增強(qiáng)，這與胡巍等[13]報(bào)道的結(jié)果有所出入。由馬錢(qián)子堿和士的寧的結(jié)構(gòu)式可知：其結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)相似，透皮吸收時(shí)產(chǎn)生同質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)抑制是有可能的。但是，不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物乃至人體皮膚的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否也類(lèi)似，以及具體機(jī)制等均需通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究加以確證。此外，研究結(jié)果還表明：馬錢(qián)子總生物堿提取物中其他生物堿等能夠促進(jìn)士的寧的透皮吸收。由此證明，馬錢(qián)子生物堿用于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療時(shí)，盡可能降低士的寧的含量，對(duì)增效減毒具有重要意義。馬錢(qián)子治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎效果顯著，但由于毒性較強(qiáng)極大限制臨床應(yīng)用。本研究的發(fā)現(xiàn)可為馬錢(qián)子的炮制和經(jīng)皮給藥制劑研究應(yīng)用等方面提供依據(jù)參考。
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