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辣椒素對(duì)非小細(xì)胞肺癌侵襲能力影響及其機(jī)制討論
近年來(lái)，關(guān)于辣椒素( capsaicin，CAP) 抗癌作用的研究在國(guó)內(nèi)外日益受到學(xué)者的高度重視。辣椒素是紅辣椒中的一種活性成分。最近有研究表明，辣椒素可以抑制癌癥細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡，因此可以作為一種藥物或傳統(tǒng)化療藥物的輔助用藥。目前惡性腫瘤占全球死因的第1 位，而肺癌是癌癥相關(guān)死亡的首要原因，5年生存率15%。據(jù)預(yù)測(cè)，到2020 年，中國(guó)將有550 萬(wàn)新發(fā)肺癌病例，死亡人數(shù)將達(dá)400 萬(wàn)。在肺癌的病理學(xué)分型中，80% 為非小細(xì)胞肺癌( non-small cell lung cancer，NSCLC) ，包括腺癌、鱗狀上皮細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌，其侵襲和轉(zhuǎn)移能力是導(dǎo)致患者死亡及復(fù)發(fā)的主要原因，并使其成為作為當(dāng)今世界上對(duì)人類健康和生命危害最大的惡性腫瘤之一，給患者和家屬及其社會(huì)帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。雖然辣椒素具有抗癌癥作用，但是其有關(guān)于NSCLC 的研究鮮見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。本研究采用人大細(xì)胞肺癌NCI-H460 細(xì)胞，旨在觀察辣椒素對(duì)NCIH460細(xì)胞侵襲能力及E 鈣黏蛋白( E-cadherin) ，Slug 蛋白表達(dá)的影響，為明確辣椒素治療惡性腫瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，探討其可能作用機(jī)制，以期為NSCLC 治療提供新思路。
1 材料
1. 1 細(xì)胞人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460，購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。
1. 2 藥物及試劑辣椒素( 純度 99%) ，MTT，羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽( 美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)分別為100081-201408，M2128，PHDR1) ，Transwell 小室( 美國(guó)Corning 公司，批號(hào)3140908 ) ，E-cadherin 蛋白，Slug 蛋白，-actin( 上海浩然生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為著名ZM0092，ZM2356，1208) ，E-cadherin鼠抗人單克隆抗體( 美國(guó)Pro Mab 公司，批號(hào)70796267A2) ，Slug 兔抗人多克隆抗體( 美國(guó)SantaCruz 公司，批號(hào)B2206) ，HRP 標(biāo)記抗鼠IgG 二抗及HRP 標(biāo)記抗兔IgG 二抗( 上海碧云天公司，批號(hào)BSE-0140G，BSE-0520G) ，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒( 日本Promega 公司，批號(hào)9035-81-8) ，Quant SYBR GreenPCR 試劑盒( 美國(guó)TaKaRa 公司，批號(hào)BS-PCR003) 。
1. 3 儀器DFC 450C 型倒置顯微鏡( 德國(guó)萊卡公司) ，ABI-7300 型PCR 儀( 美國(guó)ABI 公司) 。
2 方法
2. 1 細(xì)胞培養(yǎng)NCI-H460 細(xì)胞保存在含有10%BSA 的RPMI-1640 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基( 含L-谷氨酰胺，青霉素100 UmL - 1 和鏈霉素100 UmL - 1 ) ，37 ℃，5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。當(dāng)NCI-H460 細(xì)胞達(dá)80%匯合度時(shí)，用0. 05%胰蛋白酶/0. 02% EDTA 消化。按照細(xì)胞密度2 106 個(gè)/孔接種于超低吸附6孔板中， 37 ℃，5 %CO2及飽和濕度下培養(yǎng)48 h。收集懸浮的細(xì)胞經(jīng)EDTA 處理制備成單細(xì)胞懸液，然后用RPMI-1640 培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，備用。
2. 2 藥物配置辣椒素溶解于DMSO，配成500 mmolL - 1溶液，- 20 ℃ 保存。臨用時(shí)，以完全培養(yǎng)液將辣椒素稀釋到所需濃度。
2. 3 MTT 比色分析法測(cè)定細(xì)胞抑制率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NCI-H460 細(xì)胞，按照細(xì)胞密度1 104 個(gè)/孔接種于96 孔板中，總體積為200 L，過(guò)夜培養(yǎng)。次日，實(shí)驗(yàn)組每孔加入終濃度為0， 100， 200， 300，400，500 molL - 1的辣椒素，空白組除未加辣椒素外，其余條件與實(shí)驗(yàn)組完全一致。每組設(shè)6 個(gè)平行孔，將培養(yǎng)板置于37 ℃ 5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24， 48 h 后，每孔加入MTT 溶液( 5 gL - 1 ) 20L， 37 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，然后每孔加入DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，570 nm 波長(zhǎng)處，以空白培養(yǎng)液調(diào)零點(diǎn)，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度A，取6 孔平均值。在graphpad prism 5 統(tǒng)計(jì)軟件中計(jì)算出半數(shù)抑制濃度( IC50) 。抑制率= ( A實(shí)驗(yàn)組- A空白組) /( A空白組- A對(duì)照組) 100%。
2. 4 微絲熒光染色觀察根據(jù)江隆昌和歐陽(yáng)理權(quán)等方法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NCI-H460 細(xì)胞，按照細(xì)胞密度2 103 個(gè)細(xì)胞/接種于96 孔板中，實(shí)驗(yàn)組每孔加入終濃度為100， 200， 300 molL - 1 的辣椒素各10L，空白組除未加辣椒素外，其余條件與實(shí)驗(yàn)組完全一致。每組設(shè)6 個(gè)平行孔。PBS 洗滌2 次，再用4%多聚甲醛溶液于37 ℃固定10 min; 然后，用含0. 1%TritonX-100 的PBS 洗滌細(xì)胞3 次，每次4 min。用含0. 2%BSA 的PBS 封閉30 min。隨后，將細(xì)胞與1∶ 100羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽PBS 孵育15 min，PBS 洗滌3次。Olympus IX51 型熒光顯微鏡496 nm 處，觀察細(xì)胞微絲的形態(tài)學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。
2. 5 Transwell 小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)根據(jù)史立宏等方法，Transwell 小室用前鋪上0. 5% Matrigel膜基質(zhì)50 L 于37 ℃孵育過(guò)夜4 h。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NCI-H460 細(xì)胞，將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用終濃度為100，200，300 molL - 1 的辣椒素， 37 ℃ 5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h，空白組除未加辣椒素外，其余條件與實(shí)驗(yàn)組完全一致。按照5 104 個(gè)細(xì)胞接種于Transwell 小室內(nèi)室，并在Transwell 小室下室加入含有10% BSA 的完全培養(yǎng)液。孵育24 h 后，取出Transwell 小室去除未穿膜細(xì)胞。甲醇固定15 min 后，再以10 gL - 1 Hoechst33342 染色30 min。OlympusIX51 熒光顯微鏡計(jì)數(shù)穿過(guò)微孔膜的細(xì)胞數(shù)。每組細(xì)胞隨機(jī)計(jì)數(shù)10 個(gè)視野，取其平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。
2. 6 Western blot 分析取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NCI-H460 細(xì)胞，將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用終濃度為100， 200， 300 molL - 1的辣椒素， 37 ℃ 5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h，空白組除未加辣椒素外，其余條件與實(shí)驗(yàn)組完全一致。用細(xì)胞裂解液( 20 mmolL - 1 Tris-HCl， 1. 5%Triton X-100，150 mmolL - 1 NaCl，10% 甘油，1 mmolL - 1Na4P2O7，50 mmolL - 1 NaF，1 mmolL - 1 PMSF) 和蛋白酶抑制劑( 5 molL - 1 AEBSF-HCl，5 molL - 1EDTA，10 mmolL - 1 leupeptin，1. 5 mmolL - 1 E-64，pH 7. 4) 裂解細(xì)胞后，收集裂解液，Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。取20 g 蛋白質(zhì)加入等體積2 上樣緩沖液，95 ℃ 變性5 min。隨后進(jìn)行7. 5% SDSPAGE凝膠電泳。電泳后，電轉(zhuǎn)至0. 45 m 硝酸纖維素膜，用含5% 的脫脂奶粉PBST( 25 mmolL - 1Tris pH 7. 5， 150 mmolL - 1 NaCl，0. 1% Tween20) 封閉1 h，分別加入E-cadherin 抗體，Slug 抗體( 1∶ 1 000稀釋) 4 ℃孵育過(guò)夜，PBST 洗滌3 次，每次5 min。加入HRP 標(biāo)記的二抗( 1∶ 2 000 稀釋) 室溫孵育2 h，PBST 洗滌3 次，每次5 min。按同樣的方法與-actin 抗體孵育。ECL 化學(xué)發(fā)光試劑顯色，通過(guò)Bio-Rad 凝膠成像進(jìn)行目的條帶的表達(dá)檢測(cè)及分析。蛋白的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度= 目標(biāo)蛋白表達(dá)強(qiáng)度/-actin蛋白表達(dá)強(qiáng)度。
2. 7 Real-Time PCR( RT-PCR) 分析取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NCI-H460 細(xì)胞，將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用終濃度為100，200， 300 molL - 1 的辣椒素， 37 ℃ 5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h，空白組除未加辣椒素外，其余條件與實(shí)驗(yàn)組完全一致。按照TRIzol 試劑盒說(shuō)明書抽提總RNA。Nanodrop2000 檢測(cè)RNA 純度。使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，成單鏈的cDNA，操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。利用Pubmed查找相關(guān)基因序列，并利用引物合成軟件PrimerPremier 5. 0 設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1。使用QuantSYBR Green PCR 試劑盒按照PCR 引物進(jìn)行擴(kuò)增，用Applied Biosystems 7500 型定量PCR 儀測(cè)出Ct值及熔解曲線，計(jì)算出相對(duì)基因表達(dá)量。每份樣品檢測(cè)3 次。
2. 8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17. 0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用珋x s 表示，正態(tài)資料組間比較采用t 檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)采用單因素方差分析，以P 0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3 結(jié)果
3. 1 對(duì)NCI-H460 細(xì)胞增殖的影響不同終濃度( 100 ～ 500 molL - 1 ) 的辣椒素分別作用于NCIH460細(xì)胞24，48 h 后，隨著終濃度的增大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)細(xì)胞的抑制率也明顯增強(qiáng)，呈濃度和時(shí)間依賴性，與空白組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P 0. 05) 。辣椒素24， 48 h 的IC50分別為366. 2，328. 2 molL - 1。
3. 2 對(duì)NCI-H460 細(xì)胞絲狀偽足形成的影響微絲熒光染色后發(fā)現(xiàn)，辣椒素終濃度為100 molL - 1時(shí)，NCI-H460 細(xì)胞有明顯的絲狀偽足形成，表現(xiàn)為細(xì)胞表面形成微絲突起并且延伸到細(xì)胞外，而且充滿與相鄰的其他腫瘤細(xì)胞相接觸的平行排列肌絲纖維。辣椒素終濃度為200， 300 molL - 1 時(shí)，NCI-H460 細(xì)胞未見(jiàn)明顯絲狀偽足形成，可有效抑制絲狀偽足的伸出，僅見(jiàn)細(xì)胞表面可見(jiàn)少量突起，肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)狀排列。
3. 3 對(duì)NCI-H460 細(xì)胞體外侵襲能力的影響辣椒素終濃度為200，300 molL - 1時(shí)，NCI-H460 細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著下降，并呈濃度依賴性，與空白組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P 0. 05) 。辣椒素終濃度為100 molL - 1時(shí)，NCI-H460 細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)雖然減少，但是與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3. 4 對(duì)NCI-H460 細(xì)胞E-cadherin，Slug 蛋白表達(dá)的影響辣椒素終濃度為200， 300 molL - 1 時(shí)，顯著升高E-cadherin 表達(dá)水平，并呈濃度依賴性，與空白組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P 0. 05) 。辣椒素終濃度為200， 300 molL - 1 時(shí)，顯著降低Slug 表達(dá)水平，并呈濃度依賴性，與空白組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P 0. 05，P 0. 01) 。辣椒素終濃度為100 molL - 1 時(shí)，E-cadherin 和Slug 表達(dá)水平與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3. 5 對(duì)NCI-H460 細(xì)胞E-cadherin，Slug mRNA 表達(dá)的影響辣椒素終濃度為200， 300 molL - 1 時(shí)，顯著升高E-cadherin mRNA 表達(dá)水平，并呈濃度依賴性，與空白組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P 0. 05) 。辣椒素終濃度為200，300 molL - 1 時(shí)，顯著降低Slug mRNA 表達(dá)水平，并呈濃度依賴性，與空白組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P 0. 05，P 0. 01 ) 。辣椒素終濃度為100 molL - 1 時(shí)，Ecadherin和Slug mRNA 表達(dá)水平與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
4 討論
肺癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，其中80%為NSCLC，只有20% ～ 30% 的患者有手術(shù)機(jī)會(huì)，但是即使是在手術(shù)切除的早期NSCLC 患者中，也有2 /3 的患者存在復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)，侵襲轉(zhuǎn)移是患者死亡和治療效果不理想的主要原因。目前對(duì)于放療、化療等主要治療肺癌的手段已經(jīng)進(jìn)入平臺(tái)期，然而其分子機(jī)制尚不明了，因此探討肺癌分子水平侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制尤為必要。
近年來(lái)，傳統(tǒng)中藥應(yīng)用于抗癌癥的治療成為研究抗癌藥物的新的熱點(diǎn)，受到廣大醫(yī)藥學(xué)工作者的廣泛重視。辣椒素( 結(jié)構(gòu)為反式8-甲基-N-香草基-丁-壬烯胺) 是紅辣椒中的一種活性成分，作為食物和傳統(tǒng)藥物已有幾千年的歷史，于1999 年載入《美國(guó)藥典》。辣椒素可通過(guò)多種途徑在體內(nèi)外發(fā)揮抗癌癥作用，如劉南等研究表明，辣椒素可抑制胰腺癌裸鼠皮下移植瘤得生長(zhǎng)。另外還有報(bào)道稱，辣椒素可誘導(dǎo)人黑色素瘤A375-S2 細(xì)胞的凋亡。然而辣椒素對(duì)NSCLC 是否具有抑制作用目前尚不明了。故此，本研究以不同終濃度辣椒素作用于NCI-H460 細(xì)胞，觀察辣椒素的抗NSCLC 效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)辣椒素對(duì)NCI-H460 細(xì)胞細(xì)胞活率有一定抑制作用，提示辣椒素具有潛在的抗NSCLC 效應(yīng)。E-cadherin 是一類主要介導(dǎo)細(xì)胞之間相互黏附的鈣依賴性跨膜蛋白，主要表達(dá)在上皮細(xì)胞，廣泛參與細(xì)胞間的連接，對(duì)于維持正常上皮細(xì)胞的完整性十分重要。E-cadherin 結(jié)構(gòu)和功能異?？芍掳┘?xì)胞間黏附松散，癌細(xì)胞極易從原發(fā)部位脫落，并沿淋巴管，血管外膜及組織間隙浸潤(rùn)蔓延，破壞鄰近正常組織并繼續(xù)生長(zhǎng)，形成轉(zhuǎn)移癌。Slug 基因是Snail超家族成員之一，能識(shí)別E-cadherin 基因啟動(dòng)子上E2-box 元件以抑制靶基因E-cadherin 的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)E-cadherin 蛋白表達(dá)，共同促進(jìn)癌癥細(xì)胞的原位侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。趙志娟等研究表明，Slug 基因的過(guò)表達(dá)同時(shí)伴有E-cadherin 的低表達(dá)或缺失與誘發(fā)胰腺癌、骨肉瘤、結(jié)直腸癌、口腔鱗癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移高度相關(guān)。本研究中，以辣椒素處理NCI-H460 細(xì)胞，微絲熒光染色和Transwell 小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，辣椒素可顯著抑制絲狀偽足形成和侵襲細(xì)胞數(shù)，證明辣椒素可抑制癌癥細(xì)胞的侵襲。進(jìn)一步通過(guò)Western blot 和RT-PCR 分析結(jié)果顯示，辣椒素可減少NCI-H460 細(xì)胞Slug 蛋白和mRNA 表達(dá)，增加E-cadherin 蛋白和mRNA 的表達(dá)，揭示辣椒素可能通過(guò)抑制Slug 表達(dá)而增加Ecadherin表達(dá)來(lái)抑制癌癥的遠(yuǎn)處侵襲能力。本研究結(jié)果與趙志娟等研究結(jié)果高度類似，故此可以推測(cè)，抑制Slug 表達(dá)和增加E-cadherin 表達(dá)可抑制NSCLC 侵襲。
綜上所述，辣椒素具有明顯的NCI-H460 細(xì)胞毒性作用，可降低NCI-H460 細(xì)胞活率。而且辣椒素可通過(guò)降低Slug 表達(dá)，增加E-cadherin 表達(dá)抑制NCI-H460 細(xì)胞侵襲能力，可能是其抗NSCLC 的機(jī)制之一，為NSCLC 治療提供新的思路。
雷公藤甲素抗卵巢癌的研究進(jìn)度
卵巢癌是較為常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，嚴(yán)重影響了女性健康。有研究表明，由于病灶位于盆腔深處，早期病變難以被發(fā)現(xiàn)，約有70%的患者在確診時(shí)已處于癌癥中晚期。臨床上多以手術(shù)治療為主、放化療為輔的綜合治療方案，但似乎療效甚微，大部分晚期卵巢癌患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)及耐藥現(xiàn)象，5 年的生存率僅30%[1]。因此，迫切需要尋找能逆轉(zhuǎn)耐藥及新的抗卵巢癌藥物。雷公藤甲素(triptolide，TP)是中藥雷公藤的主要活性成分，具有廣譜、高效的抗腫瘤活性。TP 對(duì)多種腫瘤均有抑制作用，如黑素瘤、直腸癌、肺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等。近年來(lái)，TP 對(duì)婦科腫瘤的作用引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，體內(nèi)外研究表明TP 可顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并可抑制耐順鉑細(xì)胞株的生長(zhǎng)，將其與傳統(tǒng)藥物合用治療卵巢癌，可增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，其機(jī)制主要與干預(yù)細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)。
1 TP 對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制作用
1.1 單獨(dú)對(duì)卵巢癌細(xì)胞作用
體外研究發(fā)現(xiàn)，TP 可顯著抑制卵巢癌細(xì)胞株A2780、SKOV-3 的增殖，且隨著濃度的增大、時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制率升高，呈量-效、時(shí)-效關(guān)系，其48 h 半數(shù)抑制率IC50 約為34 nmol/L，而其對(duì)正常的人卵巢上皮細(xì)胞HIO-180 只有很小的影響，提示TP 對(duì)正常細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖的抑制作用存在不同的機(jī)制。相比傳統(tǒng)化療藥物順鉑、絲裂霉素和紫杉醇，TP 具有更強(qiáng)的抗腫瘤活性。此外，TP 對(duì)耐順鉑卵巢癌細(xì)胞株OVCAR-3也有顯著的抑制作用，通過(guò)干預(yù)細(xì)胞周期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，TP 對(duì)荷卵巢癌大鼠具有一定的抑制作用，且隨著濃度的升高，抑制腫瘤的作用越強(qiáng)。TP 可通過(guò)抑制大鼠體內(nèi)動(dòng)脈環(huán)新生微脈管的形成而抑制卵巢腫瘤的生長(zhǎng)[8]。用TP 處理卵巢癌細(xì)胞移植鼠，可明顯發(fā)現(xiàn)當(dāng)給藥劑量為1 mg/kg 時(shí)，小鼠腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)目減少了約80%。
1.2 與其他藥物聯(lián)合作用
當(dāng)前，臨床上針對(duì)卵巢癌的治療多采用鉑類聯(lián)合紫杉醇的化療方案，但由于卵巢癌細(xì)胞對(duì)藥物產(chǎn)生的耐受性，其療效并不樂(lè)觀。多藥耐藥蛋白1(multidrug resistance protein 1，MDR1)是一種消耗ATP 轉(zhuǎn)運(yùn)疏水性藥物移出細(xì)胞液的跨膜蛋白，是腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇、阿霉素等傳統(tǒng)化療藥物產(chǎn)生耐藥的主要原因。研究顯示，TP 可降低MDR1 蛋白的表達(dá)，將其與化療藥物合用，可協(xié)同發(fā)揮療效。TP 與紫杉醇聯(lián)合使用可逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞的耐藥，增強(qiáng)藥效，TP 與紫杉醇聯(lián)合作用于耐順鉑上皮卵巢癌細(xì)胞COC1/DDP，通過(guò)抑制PI3K/Akt/GSK3 信號(hào)通路顯著抑制癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡[11]。在較低濃度下，TP 與順鉑聯(lián)合使用對(duì)卵巢癌的抑制作用強(qiáng)于單獨(dú)使用順鉑，其抑制率隨時(shí)間延長(zhǎng)明顯增高。姜黃素是從姜黃中提取出來(lái)的一種黃色素，具有抗腫瘤、抗炎等功效，TP 聯(lián)合使用低濃度的姜黃素，可顯著降低卵巢癌細(xì)胞中熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)27 和70 的表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡[13-14]。雷公藤紅素也是雷公藤中活性物質(zhì)之一，具有抗腫瘤作用，TP 與雷公藤紅素協(xié)同作用比單獨(dú)使用TP 或雷公藤紅素對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)，使腫瘤細(xì)胞停滯于G2/M 期，并通過(guò)增加活性氧(ROS)的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
2 TP 抗卵巢癌的作用機(jī)制
2.1 干預(yù)腫瘤細(xì)胞周期
一個(gè)細(xì)胞周期的順利進(jìn)行受到嚴(yán)格的調(diào)控，而當(dāng)細(xì)胞周期出現(xiàn)了失控就會(huì)導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生和增殖。周期蛋白依賴性激酶( cyclin-dependentkinases，CDK)和周期蛋白(cyclin)協(xié)同作用，調(diào)控細(xì)胞周期。P21 是CDKs 的一種抑制劑，促進(jìn)P21 的表達(dá)可抑制cyclin-CDK 復(fù)合物的形成。Wu 等研究發(fā)現(xiàn)TP 通過(guò)激活P53，與DNA 結(jié)合后可促進(jìn)P21 的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期蛋白復(fù)合物G1-S/CDK2 和G2-M/Cdc2 的形成，阻滯卵巢癌細(xì)胞的G1/S 期和G2/M 期。
2.2 抑制HSP 的表達(dá)
HSP 是高度保守蛋白，在保護(hù)細(xì)胞對(duì)抗不利的環(huán)境因素中起重要作用。HSP 的高表達(dá)被認(rèn)為是許多癌癥發(fā)生的信號(hào)，HSP27、HSP70 和HSP90 的表達(dá)與癌癥密切相關(guān)。有研究表明HSP70 被認(rèn)為是卵巢腫瘤侵襲的標(biāo)志物，當(dāng)其在腹腔和胸腔積液中表達(dá)水平上升時(shí)，意味著患者有較低的生存率。此外，HSP27 在藥物的耐受中發(fā)揮重要作用，并在藥物耐受的卵巢癌細(xì)胞中大量表達(dá)，研究認(rèn)為HSP27是治療化療耐受腫瘤的潛在作用位點(diǎn)。TP 可下調(diào)HSP27 和HSP70 的表達(dá)，其機(jī)制為抑制熱休克轉(zhuǎn)錄因子HSF1 的活性，減少分子伴侶的表達(dá)，使敏感細(xì)胞應(yīng)激性死亡，從而有利于卵巢癌的治療。
2.3 抑制核轉(zhuǎn)錄因子-B(NF-B)的激活
NF-B 是涉及炎癥反應(yīng)的細(xì)胞核因子，參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。NF-B 是核蛋白P50 和P65 的異質(zhì)二聚體，調(diào)控著許多基因的轉(zhuǎn)錄。NF-B可通過(guò)激活抗凋亡蛋白Bcl-2 和XIAP 抑制細(xì)胞的凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的耐受，因此NF-B被認(rèn)為是許多卵巢癌耐化療藥物的主要原因。Zhong 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，TP 通過(guò)抑制線粒體復(fù)合物I，促進(jìn)ROS 的表達(dá)而抑制NF-B 的激活，進(jìn)而下調(diào)Bcl-2 和XIAP 的表達(dá)，并激活Caspase-3 通路，促進(jìn)耐順鉑卵巢癌細(xì)胞的凋亡。此外，TP 可抑制人表皮生長(zhǎng)因子受體(human epidermal growth factorreceptor，HER)2 的轉(zhuǎn)錄，其結(jié)合部位位于HER 2啟動(dòng)子上游207 和103 bp 處，而該部位含有NF-B的結(jié)合位點(diǎn)，TP 通過(guò)抑制NF-B 活性，下調(diào)HER 2的磷酸化，進(jìn)而抑制其下游的PI3K/Akt 信號(hào)通路，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡。
2.4 抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)的轉(zhuǎn)錄
HIF-1 是一種調(diào)控組織細(xì)胞對(duì)缺氧適應(yīng)性反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào)節(jié)的基因涉及血管發(fā)生、細(xì)胞能量代謝以及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、血管再生及耐藥密切相關(guān)。由于HIF-1 在腫瘤血管生成中的重要作用，其可作為卵巢癌治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。Zhou 等[8]研究發(fā)現(xiàn)TP 可有效抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV-3 的增殖，其機(jī)制為TP 顯著性抑制SKOV-3 細(xì)胞中HIF-1 mRNA 的轉(zhuǎn)錄活性，劑量依賴性抑制其下游基因血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、Bcl-2、碳酸酐酶IX 的表達(dá);并且通過(guò)特異性HIF-1 siRNA 干擾技術(shù)，可有效逆轉(zhuǎn)TP 對(duì)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制及促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用，表明HIF-1 蛋白上調(diào)參與了TP 對(duì)SKOV-3 細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。
2.5 抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)
腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散是造成癌癥患者死亡的主要原因。卵巢癌細(xì)胞的擴(kuò)散源自于直接轉(zhuǎn)移以及侵襲相鄰組織，且其擴(kuò)散與一系列復(fù)雜的蛋白水解有關(guān)，包括降低細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)和基底膜的形成?；|(zhì)金屬蛋白激酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一種在癌細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)程中發(fā)揮重要作用的蛋白水解酶，其通過(guò)下調(diào)基底膜的組分，增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性以及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，并以此促進(jìn)癌細(xì)胞進(jìn)入血管內(nèi)滲和擴(kuò)散。Zhao 等研究發(fā)現(xiàn)TP 可在mRNA 和蛋白質(zhì)水平顯著抑制卵巢癌細(xì)胞中MMP7 和MMP19 的表達(dá)，其抑制作用與TP 呈濃度依賴性。
此外，癌細(xì)胞擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要步驟是需要從周圍的細(xì)胞中脫離出來(lái)。細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附因子結(jié)合在一起，而E-鈣黏蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的黏連中起著重要作用。抑制E-鈣黏蛋白的表達(dá)，可以促進(jìn)癌細(xì)胞的分離和轉(zhuǎn)移[29]。研究表明，TP 可在體內(nèi)外顯著增加SKOV3 和A2780 細(xì)胞中E-鈣黏蛋白的表達(dá)，通過(guò)上調(diào)E-鈣黏蛋白的表達(dá)，增加細(xì)胞之間的黏附，從而減少卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。
2.6 其他作用機(jī)制
TP 抗卵巢癌的作用位點(diǎn)不斷被發(fā)現(xiàn)。分泌型卷曲相關(guān)蛋白1(secreted frizzled-related protein 1，SFRP1)與Wnt 受體的胞外區(qū)半胱氨酸富集結(jié)合域同源。SFRP1 與卷曲蛋白結(jié)合形成異二聚體使Wnt受體形成無(wú)功能性受體復(fù)合物，從而負(fù)調(diào)控Wnt 信號(hào)通路。Li 等研究發(fā)現(xiàn)，SFRP1 基因沉默可通過(guò)Wnt 途徑激活腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，而恢復(fù)SFRP1 的表達(dá)則可抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。TP 可促進(jìn)SFRP1 的表達(dá)，進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
白細(xì)胞源性精氨酸氨肽酶(leukocyte-derivedarginine aminopeptidase，LRAP)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，參與內(nèi)源性抗原肽的修飾和遞呈，可促進(jìn)人白細(xì)胞相關(guān)抗原I(HLA I)結(jié)合抗原肽;降低白細(xì)胞源性精氨酸氨肽酶(LRAP)的表達(dá)可修復(fù)受損抗原，并幫助腫瘤細(xì)胞逃逸免疫監(jiān)控。TP 可上調(diào)LRAP 的表達(dá)，通過(guò)修整結(jié)合到HLA I 上的抗原肽而使T 淋巴細(xì)胞識(shí)別并殺滅卵巢癌細(xì)胞。
3 結(jié)語(yǔ)
卵巢癌作為嚴(yán)重影響女性生命健康的五大惡性腫瘤之一，長(zhǎng)期以來(lái)都是學(xué)術(shù)界關(guān)注和研究的對(duì)象。由于卵巢癌細(xì)胞對(duì)目前臨床上常用的治療方案存在一定的耐藥性，學(xué)者們一直在尋找和開(kāi)發(fā)療效更為顯著的藥物。TP 是中藥雷公藤的有效成分，其具有廣泛的藥理作用，可多方向、多途徑、交叉發(fā)揮抗腫瘤作用。近年來(lái)將其用于抗卵巢癌的研究引起了廣泛的關(guān)注，多項(xiàng)研究證明，TP 對(duì)卵巢癌細(xì)胞具有抑制細(xì)胞增殖、阻斷細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲作用，并且一些傳統(tǒng)化療藥物耐藥的卵巢癌細(xì)胞對(duì)TP 敏感，其有望成為一種新型的抗腫瘤藥物用于卵巢癌的治療。
目前，TP 抗卵巢癌的作用靶點(diǎn)不斷被發(fā)現(xiàn)，但其抗卵巢癌的作用機(jī)制還尚不明確，其臨床應(yīng)用還受到局限。因此，在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上還需進(jìn)一步加深對(duì)TP 抗卵巢癌作用機(jī)制的基礎(chǔ)和臨床研究，以充分發(fā)揮TP 抗卵巢癌的優(yōu)勢(shì)，并不斷發(fā)掘藥物聯(lián)用的合理方案，為中藥抗卵巢癌研究提供理論基礎(chǔ)和新思路。
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