專題二 微生物的培養(yǎng)與應用

　　課題一 微生物的實驗室培養(yǎng)

　　·培養(yǎng)基：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)，是進行微生物培養(yǎng)的物質(zhì)基礎。

　　·培養(yǎng)基按照物理性質(zhì)可分為液體培養(yǎng)基 半固體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑瓊脂(是從紅藻中提取的一種多糖，在配制培養(yǎng)基中用作凝固劑)后，制成瓊脂固體培養(yǎng)基。微生物在固體培養(yǎng)基表面生長，可以形成肉眼可見的菌落。根據(jù)菌落的特征可以判斷是哪一種菌。液體培養(yǎng)基應用于工業(yè)或生活生產(chǎn)，固體培養(yǎng)基應用于微生物的分離和鑒定，半固體培養(yǎng)基則常用于觀察微生物的運動及菌種保藏等。

　　·按照成分培養(yǎng)基可分為人工合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基是用成分已知的化學物質(zhì)配制而成，其中成分的種類比例明確，常用于微生物的分離鑒定。天然培養(yǎng)基是用化學成分不明的天然物質(zhì)配制而成，常用于實際工業(yè)生產(chǎn)。

　　·按照培養(yǎng)基的用途，可將培養(yǎng)基分為選擇培養(yǎng)基和鑒定培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基是指在培養(yǎng)基中加入某種化學物質(zhì)，以抑制不需要的微生物生長，促進所需要的微生物的生長。鑒別培養(yǎng)基是根據(jù)微生物的特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品配制而成的，用以鑒別不同類別的微生物。

　　·培養(yǎng)基的化學成分包括 水 、 無機鹽 、 碳源 、 氮源 (生長因子)等。

　　·碳源：能為微生物的代謝提供碳元素的物質(zhì)。如CO2、NaHCO3等無機碳源;糖類、石油、花生粉餅等有機碳源。異養(yǎng)微生物只能利用有機碳源。單質(zhì)碳不能作為碳源。

　　·氮源：能為微生物的代謝提供氮元素的物質(zhì)。如N2、NH3、NO3-、NH4+(無機氮源)蛋白質(zhì)、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨(有機氮源)等。只有固氮微生物才能利用N2。

　　·培養(yǎng)基還要滿足微生物生長對PH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。例如，培養(yǎng)乳酸桿菌時需要在培養(yǎng)基中添加維生素，培養(yǎng)霉菌時須將培養(yǎng)基的pH調(diào)至酸性，培養(yǎng)細菌是需要將pH調(diào)至中性或微堿性，培養(yǎng)厭氧型微生物是則需要提供無氧的條件

　　·無菌技術·獲得純凈培養(yǎng)物的關鍵是防止外來雜菌的入侵，要注意以下幾個方面：

　　①對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒。

　　②將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌。

　?、蹫楸苊庵車h(huán)境中微生物的污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行。

　　④實驗操作時應避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。

　　無菌技術除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的?

　　答：無菌技術還能有效避免操作者自身被微生物感染。

　　·消毒與滅菌的區(qū)別

　　消毒指使用較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物(不包括芽孢和孢子)。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法(對于一些不耐高溫的液體)還有化學藥劑(如酒精、氯氣、石炭酸等)消毒、紫外線消毒。

　　滅菌則是指使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。滅菌方法有灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌。

　　滅菌方法：

　?、俳臃N環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法;

　　②玻璃器皿、金屬用具等使用干熱滅菌法，所用器械是干熱滅菌箱 ;

　?、叟囵B(yǎng)基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋 。

　?、鼙砻鏈缇涂諝鉁缇仁褂米贤饩€滅菌法，所用器械是紫外燈 。

　　(1)方法步驟：計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板?！　≈谱髋Ｈ飧嗟鞍纂斯腆w培養(yǎng)基

　　(2)倒平板操作的步驟：

　?、賹邕^菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拔出棉塞。

　?、谟沂帜缅F形瓶，將瓶口迅速通過火焰。

　?、塾米笫值哪粗负褪持笇⑴囵B(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基(約10～20mL)倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋。

　?、艿却桨謇鋮s凝固，大約需5～10min。然后，將平板倒過來放置，使培養(yǎng)皿蓋在下、皿底在上。

　　·倒平板操作的討論

　　1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度?

　　提示：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。

　　2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰?

　　答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。

　　3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置?

　　答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，將平板倒置，既可以防止培養(yǎng)基表面的水分過度地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。

　　4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎?為什么?

　　答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。

　　純化大腸桿菌

　　(1)微生物接種的方法最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法。

　　(2)平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作。將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體，這就是菌落。

　　(3)稀釋涂布平板法是將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。分為系列稀釋操作和涂布平板操作兩步。

　　(4)用平板劃線法和稀釋涂布平板法接種的目的是：使聚集在一起的微生物分散成單個細胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落，以便于純化菌種。

　　(5)平板劃線法操作步驟：

　?、賹⒔臃N環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)燒紅。②在火焰旁冷卻接種環(huán)，并打開棉塞。

　?、蹖⒃嚬芸谕ㄟ^火焰。④將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液。

　　⑤將試管通過火焰，并塞上棉塞。⑥左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)皿。⑦灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。⑧將平板倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　　·平板劃線操作的討論

　　1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)?在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎?為什么?

　　答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物;每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。

　　2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線?

　　答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。

　　3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線?

　　答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。

　　(6)涂布平板操作的步驟：

　?、賹⑼坎计鹘谑⒂芯凭臒小＂谌∩倭烤?，滴加到培養(yǎng)基表面。

　?、蹖⒄从猩倭烤凭耐坎计髟诨鹧嫔弦?，待酒精燃盡后，冷卻8～10s。

　?、苡猛坎计鲗⒕壕鶆虻赝坎荚谂囵B(yǎng)基表面。

　　涂布平板操作的討論

　　涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應如何進行無菌操作?

　　提示：應從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍;等等。

　　菌種的保存

　　(1)對于頻繁使用的菌種，可以采用臨時保藏的方法。

　?、倥R時保藏方法

　　將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上，在合適的溫度下培養(yǎng)。當菌落長成后，將試管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3～6個月，都要重新將菌種從舊的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上。

　?、谌秉c：這種方法保存的時間不長，菌種容易被污染或產(chǎn)生變異。

　　(2)對于需要長期保存的菌種，可以采用甘油管藏的方法。

　　在3mL的甘油瓶中，裝入1mL甘油后滅菌。將1mL培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移到甘油瓶中，與甘油充分混勻后，放在-20℃的冷凍箱中保存。

　　疑難解答

　　(1)生物的營養(yǎng)

　　營養(yǎng)是指生物攝取、利用營養(yǎng)物質(zhì)的過程。營養(yǎng)物質(zhì)是指維持機體生命活動，保證發(fā)育、生殖所需的外源物質(zhì)。

　　人及動物的營養(yǎng)物質(zhì)：水、無機鹽、糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素六類。

　　植物的營養(yǎng)物質(zhì)：礦質(zhì)元素、水、二氧化碳等三類。

　　微生物的營養(yǎng)物質(zhì)：水、無機鹽、碳源、氮源及特殊營養(yǎng)物質(zhì)五類。

　　(2)確定培養(yǎng)基制作是否合格的方法

　　將未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2天，無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。

　　課題二 土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)

　　尿素 是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥，尿素并不能直接被農(nóng)作物吸收。只有當土壤中的細菌將尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的細菌之所以能分解尿素，是因為他們能合成脲酶

　　尿素最初是從人的尿液中發(fā)現(xiàn)的

　　篩選菌株

　　(1)實驗室中微生物的篩選應用的原理

　　人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。

　　(2)選擇性培養(yǎng)基

　　在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱作選擇培養(yǎng)基。

　　(3)配制選擇培養(yǎng)基的依據(jù)

　　根據(jù)選擇培養(yǎng)的菌種的生理代謝特點加入某種物質(zhì)以達到選擇的目的。例如，培養(yǎng)基中不加入有機物可以選擇培養(yǎng)自養(yǎng)微生物;培養(yǎng)基中不加入氮元素，可以選擇培養(yǎng)能固氮的微生物;加入高濃度的食鹽可選擇培養(yǎng)金黃色葡萄球菌等。

　　統(tǒng)計菌落數(shù)目

　　(1)測定微生物數(shù)量的常用方法有稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計數(shù)。

　　(2)稀釋涂布平板法統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目的原理

　　當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活細菌。為了保證結(jié)果準確，一般設置3～5個平板，選擇菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)，并取平均值。統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低，因此，統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。

　　采用此方法的注意事項：1.一般選取菌落數(shù)在30~300之間的平板進行計數(shù)

　　2.為了防止菌落蔓延，影響計數(shù)，可在培養(yǎng)基中加入TTC(在計數(shù)瓊脂中加入適量的TTC(0.5% TTC 1ML加到100ML瓊脂中),細菌菌落長成紅顏色,對去除食品本底顆粒物干擾非常有意義).

　　3.本法僅限于形成菌落的微生物

　　設置對照

　　設置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。對照實驗是指除了被測試的條件以外，其他條件都相同的實驗，其作用是比照試驗組，排除任何其他可能原因的干擾，證明確實是所測試的條件引起相應的結(jié)果。

　　實驗設計

　　實驗設計包括實驗方案，所需儀器、材料、用具和藥品，具體的實施步驟以及時間安排等的綜合考慮和安排。

　　(1)土壤取樣：同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物，數(shù)量最大，種類最多。在富含有機質(zhì)的土壤表層，有更多的微生物生長。從富含有機物、潮濕、pH≈7的土壤中取樣。鏟去表層土，在距地表約3～8cm的土壤層取樣。

　　(2)樣品的稀釋：樣品的稀釋程度將直接影響平板上生長的菌落數(shù)目。在實際操作中，通常選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)在30~300之間、適于計數(shù)的平板。

　　測定土壤中細菌的數(shù)量，一般選用104 105 106

　　測定放線菌的數(shù)量，一般選用103 104 105

　　測定真菌的數(shù)量，一般選用102 103 104

　　(3)微生物的培養(yǎng)與觀察

　　不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。細菌30~37℃ 1~2天

　　放線菌25~28℃ 5~7天 霉菌25~28℃ 3~4天

　　每隔24小時統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，這樣可以防止因培養(yǎng)時間不足而導致一樓菌落的數(shù)目。一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下(相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時間)，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征。形狀、大小、隆起程度、顏色

　　疑難解答

　　(1)如何從平板上的菌落數(shù)推測出每克樣品中的菌落數(shù)?

　　統(tǒng)計某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計3個平板，計算出平板菌落數(shù)的平均值

　　每克樣品中的菌落數(shù)=(C/V)*M 其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)

　　課題三 分解纖維素的微生物的分離

　　纖維素，一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)。

　　纖維素與纖維素酶

　　(1)棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物，木材、作物秸稈等也富含纖維素。

　　(2)纖維素酶是一種復合酶，一般認為它至少包括三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維素最終被水解成葡萄糖，為微生物的生長提供營養(yǎng)。

　　纖維素分解菌的篩選

　　(1)篩選方法：剛果紅染色法。能夠通過顏色反應直接對微生物進行篩選。

　　(2)剛果紅染色法篩選纖維素分解菌的原理

　　剛果紅是一種染料，它可以與像纖維素這樣的多糖物質(zhì)形成紅色復合物，但并不和水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應。當我們在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復合物。當纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅-纖維素的復合物就無法形成，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈。這樣，我們就可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。

　　分離分解纖維素的微生物的實驗流程

　　土壤取樣→選擇培養(yǎng)(此步是否需要，應根據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量的多少來確定)→梯度稀釋→將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上→挑選產(chǎn)生透明圈的菌落

　　(1)土壤采集 選擇富含纖維素的環(huán)境。

　　(2)剛果紅染色法分離纖維素分解菌的步驟 倒平板操作、制備菌懸液、涂布平板

　　(3)剛果紅染色法種類

　　一種是先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進行顏色反應，另一種是在倒平板時就加入剛果紅。

　　課題延伸

　　對分解纖維素的微生物進行了初步的篩選后，只是分離純化的第一步，為確定得到的是纖維素分解菌，還需要進行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的實驗，纖維素酶的發(fā)酵方法有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種。纖維素酶的測定方法，一般是對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)生的葡萄糖進行定量的測定。

　　疑難解答

　　(1)為什么要在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌?

　　由于生物與環(huán)境的相互依存關系，在富含纖維素的環(huán)境中，纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。

　　(2)將濾紙埋在土壤中有什么作用?你認為濾紙應該埋進土壤多深?

　　將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對聚集，實際上是人工設置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應將紙埋于深約10cm左右腐殖土壤中。

　　(3)兩種剛果紅染色法的比較

　　方法一是傳統(tǒng)的方法，缺點是操作繁瑣，加入剛果紅溶液會使菌落之間發(fā)生混雜;其優(yōu)點是這樣顯示出的顏色反應基本上是纖維素分解菌的作用。方法二的優(yōu)點是操作簡便，不存在菌落混雜問題，缺點是由于纖維素和瓊脂、土豆汁中都含有淀粉類物質(zhì)，可以使能夠產(chǎn)生淀粉酶的微生物出現(xiàn)假陽性反應。但這種只產(chǎn)生淀粉酶的微生物產(chǎn)生的透明圈較為模糊，因為培養(yǎng)基中纖維素占主要地位，因此可以與纖維素酶產(chǎn)生的透明圈相區(qū)分。方法二的另一缺點是：有些微生物具有降解色素的能力，它們在長時間培養(yǎng)過程中會降解剛果紅形成明顯的透明圈，與纖維素分解菌不易區(qū)分。

　　(4)為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物?

　　在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應這種營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。