專題三 植物的組織培養(yǎng)技術(shù)

　　課題一 菊花的組織培養(yǎng)

　　植物組織培養(yǎng)的基本過程

　　細(xì)胞分化：在生物個體發(fā)育過程中，細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能上出現(xiàn)穩(wěn)定性差異的過程。

　　離體的植物組織或細(xì)胞，在培養(yǎng)了一段時間以后，會通過細(xì)胞分裂，形成愈傷組織，愈傷組織的細(xì)胞排列疏松而無規(guī)則，是一種高度液泡化的呈無定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。由高度分化的植物組織或細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織的過程，稱為植物細(xì)胞的脫分化，或者叫做去分化。脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，又可以重新分化成根或芽等器官，這個過程叫做再分化。再分化形成的試管苗，移栽到地里，可以發(fā)育成完整的植物體。

　　植物細(xì)胞工程

　　具有某種生物全套遺傳信息的任何一個活細(xì)胞，都具有發(fā)育成完整個體的能力，即每個生物細(xì)胞都具有全能性。但在生物體的生長發(fā)育過程中并不表現(xiàn)出來，這是因?yàn)樵谔囟ǖ臅r間和空間條件下，通過基因的選擇性表達(dá)，構(gòu)成不同組織和器官。

　　植物組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用有：實(shí)現(xiàn)優(yōu)良品種的快速繁殖;培育脫毒作物;制作人工種子;培育作物新品種以及細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)等。

　　·細(xì)胞分化是一種持久性的變化，它有什么生理意義?

　　使多細(xì)胞生物體中細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能趨向?qū)ｉT化，有利于提高各種生理功能的效率。

　　比較根尖分生組織和愈傷組織的異同

　　影響植物組織培養(yǎng)的條件

　　材料：不同的植物組織，培養(yǎng)的難易程度差別很大。植物材料的選擇直接關(guān)系到試驗(yàn)的成敗。植物的種類、材料的年齡和保存時間的長短等都會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。菊花組織培養(yǎng)一般選擇未開花植物的莖上部新萌生的側(cè)枝作材料。一般來說，容易進(jìn)行無性繁殖的植物容易進(jìn)行組織培養(yǎng)。選取生長旺盛嫩枝進(jìn)行組培的是嫩枝生理狀態(tài)好，容易誘導(dǎo)脫分化和再分化。

　　營養(yǎng)：離體的植物組織和細(xì)胞，對營養(yǎng)、環(huán)境等條件的要求相對特殊，需要配制適宜的培養(yǎng)基。常用的培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，其中含有的大量元素是N、P、S、K、Ca、Mg，微量元素是Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I、Co，有機(jī)物有甘氨酸、煙酸、肌醇、維生素、蔗糖等。

　　激素：植物激素中生長素和細(xì)胞分裂素是啟動細(xì)胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵性激素。在生長素存在的情況下，細(xì)胞分裂素的作用呈現(xiàn)加強(qiáng)趨勢。在培養(yǎng)基中需要添加生長素和細(xì)胞分裂素等植物激素，其濃度、使用的先后順序、用量的比例等都影響結(jié)果。

　　4、操作流程　　環(huán)境條件：PH、溫度、光等環(huán)境條件。

　　不同的植物對各種條件的要求往往不同。進(jìn)行菊花的組織培養(yǎng)，一般將pH控制在5.8左右，溫度控制在18~22℃，并且每日用日光燈照射12h.

　　配制MS固體培養(yǎng)基：配制各種母液：將各種成分按配方比例配制成的濃縮液(培養(yǎng)基母液)。

　　·使用時根據(jù)母液的濃縮倍數(shù)，計(jì)算用量，并加蒸餾水稀釋。

　　·配制培養(yǎng)基：應(yīng)加入的物質(zhì)有瓊脂、蔗糖、大量元素、微量元素、有機(jī)物和植物激素的母液，并用蒸餾水定容到1000毫升。

　　·在菊花組織培養(yǎng)中，可以不添加植物激素

　　原因是菊花莖段組織培養(yǎng)比較容易。·滅菌：采取的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌。

　　·MS培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)物質(zhì)的作用是什么?與肉湯培養(yǎng)基相比，MS培養(yǎng)基有哪些特點(diǎn)?

　　大量元素和微量元素提供植物細(xì)胞所必需的無機(jī)鹽;蔗糖提供碳源，維持細(xì)胞滲透壓;甘氨酸、維生素等物質(zhì)主要是為了滿足離體植物細(xì)胞在正常代謝途徑受到一定影響后所產(chǎn)生的特殊營養(yǎng)需求。

　　微生物培養(yǎng)基以有機(jī)營養(yǎng)為主，MS培養(yǎng)基則需提供大量無機(jī)營養(yǎng)。

　　外植體的消毒 外植體：用于離體培養(yǎng)的植物器官或組織片段。選取菊花莖段時，要取生長旺盛的嫩枝。菊花莖段用流水沖洗后可加少許洗衣粉，用軟刷輕輕刷洗，刷洗后在流水下沖洗20min左右。用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精中搖動2~3次，持續(xù)6~7s，立即將外植體取出，在無菌水中清洗。取出后仍用無菌吸水紙吸干外植體表面水分，放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化汞溶液中1~2min。取出后，在無菌水中至少清洗3次，漂洗消毒液。

　　注意：對外植體進(jìn)行表面消毒時，就要考慮藥劑的消毒效果，又要考慮植物的耐受能力。

　　接種：接種過程中插入外植體時形態(tài)學(xué)上端朝上，每個錐形瓶接種7～8個外植體。外植體接種與細(xì)菌接種相似，操作步驟相同，而且都要求無菌操作。

　　培養(yǎng)：應(yīng)該放在無菌箱中進(jìn)行，并定期進(jìn)行消毒，保持適宜的溫度(18~22℃)和光照(12h)

　　移栽：栽前應(yīng)先打開培養(yǎng)瓶的封口膜，讓其在培養(yǎng)間生長幾日，然后用流水清洗根部培養(yǎng)基。然后將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境中生活一段時間，進(jìn)行壯苗。最后進(jìn)行露天栽培。

　　栽培

　　外植體在培養(yǎng)過程中可能會被污染，原因有外植體消毒不徹底;培養(yǎng)基滅菌不徹底;接種中被雜菌污染;錐形瓶密封性差等。

　　課題二 月季的花藥培養(yǎng)

　　被子植物的花粉發(fā)育被子植物的雄蕊通常包含花絲、花藥兩部分?；ㄋ帪槟覡罱Y(jié)構(gòu)，內(nèi)部含有許多花粉?；ǚ凼怯苫ǚ勰讣?xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂而形成的，因此，花粉是單倍體的生殖細(xì)胞。被子植物花粉的發(fā)育要經(jīng)歷小孢子四分體時期、單核期和雙核期等階段。在小孢子四分體時期，4個單倍體細(xì)胞連在一起，進(jìn)入單核期時，四分體的4個單倍體細(xì)胞彼此分離，形成4個具有單細(xì)胞核的花粉粒。這時的細(xì)胞含濃厚的原生質(zhì)，核位于細(xì)胞的中央(單核居中期)。隨著細(xì)胞不斷長大，細(xì)胞核由中央移向細(xì)胞一側(cè)(單核靠邊期)，并分裂成1個生殖細(xì)胞核和1個花粉管細(xì)胞核，進(jìn)而形成兩個細(xì)胞，一個是生殖細(xì)胞，一個是營養(yǎng)細(xì)胞。生殖細(xì)胞將在分裂一次，形成兩個精子。

　　注意：①成熟的花粉粒有兩類，一類是二核花粉粒，其花粉粒中只含花粉管細(xì)胞核和生殖細(xì)胞核，二核花粉粒的精子是在花粉管中形成的;另一類是三核花粉粒，花粉在成熟前，生殖細(xì)胞就進(jìn)行一次有絲分裂，形成兩個精子，此花粉粒中含有兩個精子核和一個花粉管核(營養(yǎng)核)②花粉發(fā)育過程中的四分體和動物細(xì)胞減數(shù)分裂的四分體不同?；ǚ郯l(fā)育過程中的四分體是花粉母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂形成的4個連在一起的單倍體細(xì)胞;而動物細(xì)胞減數(shù)分裂過程中的四分體是聯(lián)會配對后的一對同源染色體，由于含有四條染色單體而稱為四分體。③同一生殖細(xì)胞形成的兩個精子，其基因組成完全相同。

　　產(chǎn)生花粉植株的兩種途徑通過花藥培養(yǎng)產(chǎn)生花粉植株(即單倍體植株)一般有兩種途徑，一種是花粉通過胚狀體階段發(fā)育為植物，另一種是花粉在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上先形成愈傷組織，再將其誘導(dǎo)分化成植株。這兩種途徑之間并沒有絕對的界限，主要取決于培養(yǎng)基中激素的種類及其濃度配比。

　　注意：①無論哪種產(chǎn)生方式，都要先誘導(dǎo)生芽，再誘導(dǎo)生根②胚狀體：植物體細(xì)胞組織培養(yǎng)過程中，誘導(dǎo)產(chǎn)生的形態(tài)與受精卵發(fā)育成的胚非常類似的結(jié)構(gòu)，其發(fā)育也與受精卵發(fā)育成的胚類似，有胚芽、胚根、胚軸等完整結(jié)構(gòu)，就像一粒種子，又稱為細(xì)胞胚。

　　影響花藥培養(yǎng)的因素誘導(dǎo)花粉能否成功及誘導(dǎo)成功率的高低，受多種因素影響，其中材料的選擇與培養(yǎng)基的組成是主要的影響因素

　　·親本的生理狀況：花粉早期是的花藥比后期的更容易產(chǎn)生花粉植株，選擇月季的初花期。

　　·合適的花粉發(fā)育時期：一般來說，在單核期，細(xì)胞核由中央移向細(xì)胞一側(cè)的時期，花藥培養(yǎng)成功率最高

　　·花蕾：選擇完全未開放的花蕾

　　·親本植株的生長條件、材料的低溫預(yù)處理以及接種密度等對誘導(dǎo)成功率都有一定影響

　　·材料的選?。哼x擇花藥時，一般要通過鏡檢來確定其中的花粉是否處于適宜的發(fā)育期。確定花粉發(fā)育時期的最常用的方法是醋酸洋紅法。但是，某些植物的花粉細(xì)胞核不易著色，需采用焙花青-鉻礬法，這種方法能將花粉細(xì)胞核染成藍(lán)黑色

　　·材料的消毒

　　·接種和培養(yǎng)：滅菌后的花蕾，要在無菌條件下除去萼片和花瓣，并立即將花藥接種到培養(yǎng)基上。在剝離花藥時，要盡量不損傷花藥(否則接種后容易從受傷部位長生愈傷組織)，同時還要徹底去除花絲，因?yàn)榕c花絲相連的花藥不利于愈傷組織或胚狀體的形成，通常每瓶接種花藥7～10個,培養(yǎng)溫度控制在25℃左右,不需要光照.幼小植株形成后才需要光照.一般經(jīng)過20～30天培養(yǎng)后,會發(fā)現(xiàn)花藥開裂,長出愈傷組織或形成胚狀體。將愈傷組織及時轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，以便進(jìn)一步分化出再生植株。如果花藥開裂釋放出胚狀體，則一個花藥內(nèi)就會產(chǎn)生大量幼小植株，必須在花藥開裂后盡快將幼小植株分開，分別移植到新的培養(yǎng)基上，否則這些植株將很難分開。還需要對培養(yǎng)出來的植株做進(jìn)一步的鑒定和篩選。

　　植物組織培養(yǎng)技術(shù)與花藥培養(yǎng)技術(shù)的相同之處是：培養(yǎng)基配制方法、無菌技術(shù)及接種操作等基本相同。兩者的不同之處在于：花藥培養(yǎng)的選材非常重要，需事先摸索時期適宜的花蕾;花藥裂開后釋放出的愈傷組織或胚狀體也要及時更換培養(yǎng)基;花藥培養(yǎng)對培養(yǎng)基配方的要求更為嚴(yán)格。這些都使花藥培養(yǎng)的難度大為增加。

　　樣品水分含量(%)計(jì)算公式如下：

　　(烘干前容器和樣品質(zhì)量-烘干后容器和樣品質(zhì)量)/烘干前樣品質(zhì)量

　　·毛霉的生長：條件：將豆腐塊平放在籠屜內(nèi)，將籠屜中的控制在15～18℃，并保持一定的溫度。

　　來源：1.來自空氣中的毛霉孢子，2.直接接種優(yōu)良毛霉菌種

　　時間：5天

　　·加鹽腌制：將長滿毛霉的豆腐塊分層整齊地?cái)[放在瓶中，同時逐層加鹽，隨著層數(shù)的加高而增加鹽量，接近瓶口表面的鹽要鋪厚一些。加鹽腌制的時間約為8天左右。

　　·用鹽腌制時，注意控制鹽的用量：鹽的濃度過低，不足以抑制微生物的生長，可能導(dǎo)致豆腐腐敗變質(zhì);鹽的濃度過高會影響腐乳的口味

　　·食鹽的作用：1.抑制微生物的生長，避免腐敗變質(zhì)2.析出水分，是豆腐變硬，在后期制作過程中不易酥爛3.調(diào)味作用，給腐乳以必要的咸味4.浸提毛酶菌絲上的蛋白酶。

　　·配制鹵湯：鹵湯直接關(guān)系到腐乳的色、香、味。鹵湯是由酒及各種香辛料配制而成的。鹵湯中酒的含量一般控制在12%左右。

　　·酒的作用：1.防止雜菌污染以防腐2.與有機(jī)酸結(jié)合形成酯，賦予腐乳風(fēng)味3.酒精含量的高低與腐乳后期發(fā)酵時間的長短有很大關(guān)系，酒精含量越高，對蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延長;酒精含量過低，蛋白酶的活性高，加快蛋白質(zhì)的水解，雜菌繁殖快，豆腐易腐敗，難以成塊。

　　·香辛料的作用：1.調(diào)味作用2.殺菌防腐作用3.參與并促進(jìn)發(fā)酵過程

　　·防止雜菌污染：①用來腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干凈后要用沸水消毒。②裝瓶時，操作要迅速小心。整齊地?cái)[放好豆腐、加入鹵湯后，要用膠條將瓶口密封。封瓶時，最好將瓶口通過酒精燈的火焰，防止瓶口被污染。

　　疑難解答

　　(1)利用所學(xué)的生物學(xué)知識，解釋豆腐長白毛是怎么一回事?

　　豆腐生長的白毛是毛霉的白色菌絲。嚴(yán)格地說是直立菌絲，在豆腐中還有匍匐菌絲。

　　(2)為什么要撒許多鹽，將長毛的豆腐腌起來?

　　鹽能防止雜菌污染，避免豆腐腐敗。

　　(3)我們平常吃的豆腐，哪種適合用來做腐乳?

　　含水量為70%左右的豆腐適于作腐乳。用含水量高的豆腐制作腐乳，不易成形。

　　(4)吃腐乳時，你會發(fā)現(xiàn)腐乳外部有一層致密的“皮”。這層“皮”是怎樣形成的呢?它對人體有害嗎?它的作用是什么?

　　“皮”是前期發(fā)酵時在豆腐表面上生長的菌絲(匍匐菌絲)，對人體無害。它能形成腐乳的“體”，使腐乳成形。
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