高一生物血紅蛋白的提取和分離介紹
高一生物血紅蛋白的提取和分離介紹
高一主要學(xué)習(xí)的內(nèi)容是細胞，學(xué)生需要知道和掌握這些的知識，下面是學(xué)習(xí)啦小編給大家?guī)淼挠嘘P(guān)于血紅蛋白的提取和分離知識點的介紹，希望能夠幫助到大家。
高一生物血紅蛋白的提取和分離知識點
該知識點包括凝膠色譜法、緩沖溶液、電泳、實驗操作及操作提示等幾個要點知識。
1. 凝膠色譜法：也稱做分配色譜法，是根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。凝膠實際上是一些由多糖類化合物構(gòu)成的多孔球體，在小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子通過凝膠時速度不同，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)比較容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢;而相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。
2. 緩沖溶液：緩沖溶液的作用是能夠抵制外界的酸和堿對溶液pH的影響，維持pH基本不變。緩沖溶液通常由1-2種緩沖溶劑溶解于水中配制而成的。生物體內(nèi)進行的各種生物化學(xué)反應(yīng)都是在一定的pH下進行的，例如：血漿的pH是7.35～7.45，要在實驗條件下準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的過程，必須保持體外的pH與體內(nèi)的基本一致。
3.電泳：電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸等都具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團會帶上正電或負電。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。
兩種常用的電泳方法是瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳，在測定蛋白質(zhì)分子量時通常使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速率取決于蛋白質(zhì)所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。
4. 實驗操作及操作提示：蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定。
血紅蛋白的提取和分離過程中應(yīng)注意：
(1)紅細胞洗滌過程中，洗滌三次后，如上清液仍有黃色，可增加洗滌次數(shù)，否則無法除去血漿蛋白;離心時轉(zhuǎn)速要低，時間要短，否則白細胞等會一同沉淀，達不到分離效果。
(2)血紅蛋白釋放過程中，蒸餾水的作用是漲破紅細胞，甲苯作用主要是溶解細胞膜。
(3)為了加快干凝膠的膨脹，可將加入洗脫液的濕凝膠用沸水浴加熱，通常只需1～2 h，還可除去凝膠中可能帶有的微生物，排除膠粒內(nèi)的空氣。
(4)在色譜柱中填凝膠的時候要盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。在裝填凝膠柱時，不得有氣泡存在，因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。在凝膠色譜操作過程中，不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生上述兩種情況，凝膠色譜柱需要重新裝填。
(5)滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，不要破壞凝膠面。
(6)根據(jù)紅色區(qū)帶的移動狀況判斷收集流出液時間。
【血紅蛋白的提取和分離考點分析】
在平常測試中，該知識點多以選擇題或填空題的形式出現(xiàn)。通常考查蛋白質(zhì)的提取方法、原理、實驗操作等基礎(chǔ)知識。出題形式靈活，難度中等。從近3年高考生物試題看，只是在2013年的四川卷中有一個空涉及到了凝膠色譜法。今年可能會考查這個知識點，一定要夯實基礎(chǔ)知識。
【血紅蛋白的提取和分離知識點誤區(qū)】
提取蛋白質(zhì)的方法易混淆，對血紅蛋白提取步驟及相關(guān)注意事項掌握不牢也是做錯題的原因之一。因此，要突破本專題：首先，要掌握血紅蛋白的提取原理：蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力等，可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì)。其次，要掌握相關(guān)方法：凝膠色譜法和電泳法(常用的電泳法有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳)。最后，要掌握血紅蛋白的提取和分離步驟及相關(guān)注意事項。
【典型例題】紅細胞中含有大量的血紅蛋白，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液進行實驗來提取和分離血紅蛋白。下列對血紅蛋白提取和分離的敘述，錯誤的是 ( )
A.血紅蛋白提取和分離一般按照樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定的順序進行
B.純化過程中要用生理鹽水充分溶脹凝膠來配制凝膠懸浮液
C.粗分離中透析的目的是去除相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)
D.可經(jīng)SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定
答案：B
解析：蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。提取和分離血紅蛋白時，首先通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品處理;再通過透析法除去相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離;然后通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量較大的雜蛋白除去，即樣品純化，純化過程中凝膠應(yīng)用蒸餾水充分溶脹后，配制成凝膠懸浮液，而不是用生理鹽水;最后經(jīng)SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定。
高一生物基因工程的應(yīng)用知識點
該知識點包括植物基因工程碩果累累、動物基因工程前景廣闊、基因工程藥物異軍突起、基因治療曙光初照等幾個要點知識。
1. 植物基因工程碩果累累：殺蟲基因：主要有Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因、植物凝集素基因等。優(yōu)點：減小生產(chǎn)成本，減少環(huán)境污染。
(1)抗病轉(zhuǎn)基因植物：抗病基因：使用最多的是病毒外殼蛋白基因和病毒的復(fù)制酶基因;抗真菌轉(zhuǎn)基因植物中可使用的基因有幾丁質(zhì)酶基因、抗毒素合成基因。
(2)其他抗逆轉(zhuǎn)基因植物：抗逆基因：調(diào)節(jié)滲透壓的基因(使植物細胞滲透壓升高以適應(yīng)鹽堿或干旱環(huán)境)、抗凍蛋白基因、抗除草劑基因。作用：以提高植物對環(huán)境適應(yīng)能力。
(3)利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)：舉例：將必需氨基酸含量多的蛋白質(zhì)編碼基因?qū)胫参镏?，或者改變這些氨基酸合成途徑中某種關(guān)鍵酶的活性，以提高植物氨基酸含量。
2. 動物基因工程前景廣闊：主要體現(xiàn)在：用于提高動物生長速度(生長激素基因);用于改善畜產(chǎn)品的品質(zhì);用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物(乳腺生物反應(yīng)器);用轉(zhuǎn)基因動物作器官移植的供體。
乳腺生物反應(yīng)器的操作過程為：將藥用蛋白基因與乳腺蛋白基因的啟動子等調(diào)控組件重組在一起，通過顯微注射等方法，導(dǎo)入哺乳動物的受精卵中，然后，將受精卵送入母體內(nèi)，使其生長發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物。
為解決器官移植中的免疫排斥反應(yīng)，科學(xué)家正在想辦法對豬的器官進行改造，采用的方法是將器官供體基因組導(dǎo)入某種調(diào)節(jié)因子，以抑制抗原決定基因的表達;或設(shè)法除去抗原決定基因，結(jié)合克隆技術(shù)，培育出沒有免疫排斥反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因克隆豬器官。
3. 基因工程藥物異軍突起：利用基因工程能高效地生產(chǎn)出各種高質(zhì)量、低成本藥品。目前，用基因工程方法生產(chǎn)的藥物已經(jīng)有六十余種，除胰島素、干擾素外，還有白細胞介素、溶血栓劑、凝血因子、人造血液代用品，以及預(yù)防乙肝、狂犬病、百日咳、霍亂、傷寒、虐疾等疾病的各類疫苗。
4. 基因治療曙光初照：基因治療是把正常基因?qū)氩∪梭w內(nèi)，使該基因的表達產(chǎn)物發(fā)揮功能，從而達到治療疾病的目的，這是治療遺傳病的最有效手段。這種治療依據(jù)的是遺傳病患者一般缺少正常基因，所以導(dǎo)入正?；蚝?，使其表達，即可對病情起到緩解作用。
【基因工程的應(yīng)用考點分析】
在平常測試中，該知識點比例不大，多以選擇題或簡答題的形式出現(xiàn)。通常考查基因工程的相關(guān)應(yīng)用知識。在高考中，從近幾年生物試題看，全國課標(biāo)卷涉及很少，在單科生物試卷中考查也不多，只是在考查基因工程的過程中，有個別的填空而已。希望同學(xué)們記住相關(guān)基礎(chǔ)知識。
【基因工程的應(yīng)用知識點誤區(qū)】
有關(guān)基因工程應(yīng)用的易錯點主要有：①動物基因工程主要是為了改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)，而不是為了產(chǎn)生體型巨大的個體。②DNA分子作探針進行檢測時應(yīng)檢測單鏈，即將待測雙鏈DNA分子打開。③Bt毒蛋白基因控制合成的Bt毒蛋白并無毒性，進入昆蟲消化道被分解成多肽后產(chǎn)生毒性。④青霉素是青霉菌產(chǎn)生的，不是通過基因工程產(chǎn)生的。⑤并非所有個體都可作為乳腺生物反應(yīng)器。操作成功的應(yīng)該是雌性個體，個體本身的繁殖速度較高，泌乳量、蛋白含量等都是應(yīng)該考慮的因素。⑥基因治療后，缺陷基因沒有改變。基因治療是把正?；?qū)胧荏w細胞中，以表達正常產(chǎn)物從而治療疾病，對原來細胞中存在缺陷的基因沒有清除或改變。
【典型例題】科學(xué)家利用基因工程技術(shù)可以使哺乳動物本身變成“批量生產(chǎn)藥物的工廠”。目前科學(xué)家已在牛和羊等動物的乳腺生物反應(yīng)器中表達出了抗凝血酶、血清白蛋白、生長激素等重要藥品。請回答有關(guān)問題：
(1)將藥用蛋白基因和乳腺蛋白基因的啟動子、終止子和______________等重組在一起，就可構(gòu)建基因表達載體，再通過____________技術(shù)即可導(dǎo)入受精卵中。
(2)制備乳腺生物反應(yīng)器的過程中，目的基因的受體細胞為____________，性染色體組成為________。
(3)為確定受體細胞中染色體的DNA上是否插入了目的基因，可利用____________技術(shù)進行檢測，一般是用放射性同位素標(biāo)記________________________________作探針。
(4)轉(zhuǎn)化成功的受精卵發(fā)育成胚胎需要進行體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中要加入____________等天然成分。
答案：(1)標(biāo)記基因 顯微注射 (2)受精卵 XX (3)DNA分子雜交 含有目的基因的DNA片段 (4)血清
解析：基因表達載體的組成，除了目的基因，還必須有啟動子、終止子及標(biāo)記基因。顯微注射技術(shù)是轉(zhuǎn)基因動物操作中采用最多、也最有效的方法。制備乳腺生物反應(yīng)器的過程中，子代個體須有乳房，所以受體為雌性，其性染色體組成為XX。將含有目的基因的DNA片段用放射性同位素標(biāo)記作探針，用DNA分子雜交技術(shù)可檢測目的基因是否成功插入了受體細胞染色體的DNA上。
高一生物基因工程的基本操作程序知識點
該知識點包括目的基因的獲取、基因表達載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細胞、目的基因的檢測與鑒定等幾個要點知識。
1. 目的基因的獲?。耗康幕蚴侵妇幋a蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。原核基因采取直接分離獲得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法。直接分離目的基因的方法有：①從基因組文庫中獲取：即用限制酶進行切割、分離;②從cDNA文庫中獲?。杭蠢胢RNA反轉(zhuǎn)錄形成;③利用PCR擴增技術(shù)：獲取大量目的基因。人工化學(xué)合成適用于分子較小的基因。
2. 基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟。
目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在、能夠表達和發(fā)揮作用，并且可以遺傳至下一代。
組成：目的基因+啟動子+終止子+標(biāo)記基因。
啟動子：是一段特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質(zhì)。
終止子：也是一段特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段 ，位于基因的尾端。
標(biāo)記基因的作用：是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。常用的標(biāo)記基因是抗生素抗性基因。
3. 將目的基因?qū)胧荏w細胞：(以下知識要點是同學(xué)們必須要掌握的)
轉(zhuǎn)化：是目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。
常用的轉(zhuǎn)化方法：將目的基因?qū)胫参锛毎翰捎米疃嗟姆椒ㄊ?農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，其次還有基因槍法和花粉管通道法等。將目的基因?qū)雱游锛毎鹤畛Ｓ玫姆椒ㄊ?顯微注射技術(shù)。此方法的受體細胞多是受精卵。將目的基因?qū)胛⑸锛毎涸松镒鳛槭荏w細胞的原因是繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對較少 ，最常用的原核細胞是大腸桿菌 ，其轉(zhuǎn)化方法是：先用 Ca2+ 處理細胞，使其成為感受態(tài)細胞 ，再將重組表達載體DNA分子 溶于緩沖液中與感受態(tài)細胞混合，在一定的溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化過程。重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細胞后，篩選含有基因表達載體受體細胞的依據(jù)是標(biāo)記基因是否表達。
4.目的基因的檢測與鑒定：(1)首先要檢測 轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子雜交技術(shù)。(2)其次還要檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，方法是采用用標(biāo)記的目的基因作探針與mRNA雜交。(3)最后檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，方法是從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進行抗原-抗體雜交。(4)有時還需進行個體生物學(xué)水平的鑒定。如轉(zhuǎn)基因抗蟲植物是否出現(xiàn)抗蟲性狀。
【基因工程的基本操作程序考點分析】
在平常測試中，該知識點有較大比例，多以選擇題或簡答題的形式出現(xiàn)。通?？疾榛蚬こ袒静僮鞑襟E及相關(guān)步驟的實施方法、要點及涉及的酶等多方面的的知識，出題形式多以基因工程模式圖為背景切入，難度中等。在高考中，從近幾年生物試題看，本部分知識一直是高考命題的熱點，題目多以簡答題形式考查。以新科技材料及圖解為背景切入，考查的知識點比較基礎(chǔ)。所以同學(xué)們要認(rèn)真記憶上述基礎(chǔ)知識。
【基因工程的基本操作程序知識點誤區(qū)】
本部分易錯問題主要集中在：獲取目的基因的方法、基因表達載體的結(jié)構(gòu)、目的基因?qū)爰毎姆椒澳康幕蜩b定與檢測的方法。同學(xué)們在復(fù)習(xí)時一定要關(guān)注以下易錯點：
(1)目的基因的插入位點不是隨意的：基因表達需要啟動子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入到啟動子與終止子之間的部位。
(2)基因工程操作過程中只有第三步(將目的基因?qū)胧荏w細胞)沒有堿基互補配對現(xiàn)象。第一步逆轉(zhuǎn)錄法獲得DNA，第二步黏性末端連接，第四步檢測分子水平雜交方法。
(3)原核生物作為受體細胞的優(yōu)點：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對較少。
(4)一般情況下，用同一種限制酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的片段，但有時可用兩種限制酶分別切割質(zhì)粒和目的基因，這樣可避免質(zhì)粒和質(zhì)粒之間、目的基因和目的基因之間的連接。
(5)目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程，稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的實質(zhì)是目的基因整合到受體細胞染色體基因組中。
(6)不熟悉標(biāo)記基因的種類和作用：標(biāo)記基因的作用——篩選、檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細胞，常見的有抗生素抗性基因、發(fā)光基因(表達產(chǎn)物為帶顏色的物質(zhì))等。
(7)對受體細胞模糊不清：受體細胞常用植物受精卵或體細胞(經(jīng)組織培養(yǎng))、動物受精卵(一般不用體細胞)、微生物(大腸桿菌、酵母菌)等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰島素則必須用真核生物酵母菌(需內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的加工、分泌);一般不用支原體，原因是它營寄生生活;一定不能用哺乳動物成熟的紅細胞，原因是它無細胞核，不能合成蛋白質(zhì)。
(8)還應(yīng)注意的問題有：①基因表達載體中，啟動子(DNA片段)≠起始密碼子(RNA);終止子(DNA片段)≠終止密碼子(RNA)。②基因表達載體的構(gòu)建是最核心、最關(guān)鍵的一步，在體外進行。
【典型例題】
浙江大學(xué)農(nóng)學(xué)院喻景權(quán)教授課題組研究發(fā)現(xiàn)，一種植物激素——油菜素內(nèi)酯能促進農(nóng)藥在植物體內(nèi)的降解和代謝。用油菜素內(nèi)酯處理后，許多參與農(nóng)藥降解的基因(如P450基因和紅霉素抗性基因)的表達和酶活性都得到提高，在這些基因“指導(dǎo)”下合成的蛋白酶能把農(nóng)藥逐漸轉(zhuǎn)化為水溶性物質(zhì)或低毒甚至無毒物質(zhì)，有的則被直接排出體外。某課題組進一步進行了如下的實驗操作，請回答下列問題：
(1)獲得油菜素內(nèi)酯合成酶基因的方法有____________________________________。步驟①用PCR技術(shù)擴增基因時用到的耐高溫酶通常是指____________________________;步驟②用到的酶有_______________________________________________________________。
(2)圖中導(dǎo)入重組質(zhì)粒的方法是_________，在導(dǎo)入之前應(yīng)用一定濃度的______________處理受體細菌。
(3)導(dǎo)入重組質(zhì)粒2以后，往往還需要進行檢測和篩選，可用____________________制成探針，檢測是否導(dǎo)入了重組基因，在培養(yǎng)基中加入________________可將含有目的基因的細胞篩選出來。
(4)請你為該課題命名：____________________________________________________。
答案：(1)從cDNA文庫中獲取、從基因組文庫中獲取、人工合成目的基因或PCR擴增技術(shù)(任選其中兩項即可) TaqDNA聚合酶 限制酶和DNA連接酶 (2)轉(zhuǎn)化法 氯化鈣溶液 (3)紅霉素抗性基因 紅霉素(4)探究油菜素內(nèi)酯能否促進土壤中農(nóng)藥的分解
解析：進行基因工程操作時，首先要獲取目的基因，其方法有多種：從cDNA文庫中獲取、從基因組文庫中獲取、人工合成目的基因或PCR擴增技術(shù)等。在構(gòu)建基因表達載體的過程中，用到的工具酶有限制酶和DNA連接酶。圖中的受體細胞是細菌，故用轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入基因表達載體，導(dǎo)入后，需檢驗和篩選。從圖中可以看出，最終是通過對照實驗來檢驗轉(zhuǎn)基因細菌對土壤中殘留農(nóng)藥的分解能力。
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